無黑色素普魯蘭多糖出芽短梗霉的選育

,,, ,,,繼棟,,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004;2.廣西蔗糖產業協同創新中心,廣西南寧 530004)

無黑色素普魯蘭多糖出芽短梗霉的選育

張若璇1,孫帥楠1,孫欽菊1,劉鑫1,杭方學1,2,劉繼棟1,2,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004;2.廣西蔗糖產業協同創新中心,廣西南寧 530004)

為選育一株高產無黑色素普魯蘭多糖的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans),以A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#為出發菌株,通過紫外誘變(15 W)篩選出三株正突變菌株作為親本。在此基礎上,對三株親本制備原生質體并采用35%的PEG4000介導進行全基因重組(Genome shuffling,GS)。隨后,經雙親滅活篩選后獲得A.pullulans的全基因重組菌F2-6。結果表明,菌株F2-6遺傳性狀穩定且發酵多糖產物中近乎無黑色素(OD654維持在0.02左右),多糖產量提高至(19.53±0.39) g/L,比原始菌As.3#提高119.69%,表明重組菌F2-6具有工業化生產普魯蘭多糖的潛能。

出芽短梗霉,普魯蘭多糖,全基因重組,黑色素

普魯蘭多糖是一種極性真菌胞外多糖,具有良好的成膜性[1]、抗菌性[2]、耐熱性[3]等特性,廣泛應用于食品和生物制藥等領域[4-5]。目前,工業上多通過出芽短桿霉(Aureobasidiumpullulans)發酵生產普魯蘭多糖,但是普遍存在產量低、產物黑色素累積等問題,提高了純化成本并限制了其應用范圍[6]。學者曾通過控制培養基中碳源[7]、氮源[8]及pH[9]等方式調控A.pullulans的生產能力及多糖產物的黑色素含量,但仍未達到工業化生產的需要。因此,選育一株高產普魯蘭多糖且不積累黑色素的菌株是當前急需解決的關鍵科學問題之一。

目前,由于A.pullulans的表達系統構建仍未完善,從普魯蘭多糖合成機理及基因遺傳機理入手改造出芽短桿霉菌株還面臨諸多困難。雖然有報道中曾將普魯蘭多糖的編碼基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)等宿主菌內進行表達[10],但其多糖產物在食品、藥品領域中的應用存在安全性爭議[11]。當前,對A.pullulans的遺傳改造仍以傳統誘變方式為主。王雪松等[12]使用He-Ne激光對A.pullulans原生質體進行誘變,突變菌株普魯蘭多糖的含量增加到了26.65 g/L,是原始菌株的10.6倍,報道中并未提及誘變菌發酵產物的黑色素積累情況。靳建忠等[13]通過紫外誘變的方法對菌株A.pullulansNG進行改良,獲得一株高產無黑色素普魯蘭多糖的突變株UVMU3-1,然其搖瓶水平的多糖產量在改組前后并未發生明顯變化。萬翠香[14]等采用紫外、亞硝基胍及硫酸二乙酯對A.pullulans進行了多輪誘變,獲得的變異菌P1012的黑色素產量較低,其多糖的積累量提高至28.01 g/L。然而,由于傳統誘變的方式需要進行大量誘變與篩選過程,正向突變發生的幾率較小且不可控,導致育種效率較低。

基因改組技術基于對發菌株的遺傳信息的保守性高效定向改造,并未進入任何外源遺傳信息,可以使研究人員在短時間內選育到所需的菌株[15]。資料顯示,兩輪基因改組得到的結果大致相當于傳統誘變方法20輪的誘變與篩選[16]。目前,在普魯蘭多糖的高產菌株選育方面,全基因重組(GS)得到了研究者的廣泛關注。如馮印[17]等對A.pullulans進行全基因重組獲得的改組菌的多糖產量分別比出發菌株提高了71.22%,但并未提及改組菌多糖產物的顏色。Kang等[18]通過基因組改組處理A.pullulansN3.387,其產物產量提高至20.7 g/L,相對于野生菌株提高了179.7%,同樣的,該改組菌產生的多糖產物也含有黑色素成分。張晶[19]等通過GS,選育了2株改組菌,其多糖產量提高至42.38 g/L及42.6 g/L,同時,其發酵液OD654值比出發菌株分別降低了17.30%和20.57%,表明其產物黑色素成分含量有所降低。

基于目前尚未有適合工業化應用不積累黑色素的A.pullulans菌株,本研究擬以A.pullulansAs.40329和As.3#為出發菌,通過紫外誘變構建親本突變庫,選育性狀優良的菌株進行全基因重組,以期獲得一株高產無黑色素普魯蘭多糖的重組菌。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

出芽短桿霉(A.pullulans)As.40329和(A.pullulans)As.3# 本研究室保藏;蔗糖、無水乙醇、Tris、氯化鈉 均為常規分析純，上海國藥集團;溶菌酶 活性:>22800 U/mg,生工生物工程(上海)股份有限公司;普魯蘭標準品 Sigma公司;種子培養基(g/L) 磷酸氫二鉀6,磷酸二氫鉀2,硝酸鈉1.54,氯化鈉2,七水硫酸鎂0.04,四水氯化錳0.006,六水氯化鐵0.002,鹽酸硫胺素0.004,葡萄糖30,酵母膏1;發酵培養基(g/L) 磷酸氫二鉀7,硫酸銨0.4,氯化鈉1,硫酸鎂0.1,酵母膏1.5,蔗糖50;PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(g/L) 馬鈴薯200,瓊脂20,葡萄糖20;雙層再生培養基 上層培養基(g/L):蔗糖60,磷酸氫二鉀5,氯化鈉1,硫酸鎂0.2,硫酸銨0.6,酵母膏2.5,瓊脂粉15;下層培養基瓊脂粉23,其他成分與上層培養基相同;以上培養基均調節初始pH為5.8,121 ℃滅菌20 min;高滲緩沖液 25 mmol/L的Tris-HCl,含85.5 g/L蔗糖,pH6.0;酶緩沖液 2.365 g/L的KCl,25 mmol/L的Tris-HCl,pH5.0;預處理溶液 0.05 mol/Lβ-巰基乙醇,pH5.0。上述緩沖液均經無菌處理后備用。

YXQ-LS-18SI自動型手提滅菌器 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;BSD-YX(F)2600特大容量立式搖床 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;SHP-150恒溫生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司;VS-840K-U潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;5418R小型高速冷凍離心機 德國艾本德(Eppendorf)中國有限公司;Mettler Toledo AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;微孔濾膜針孔過濾器 德國MEMBRANA公司;OLYMPUS CX41-32C02奧林巴斯生物顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 親本突變庫的構建 將A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#培養至對數期,分別收集菌體并用10 mL無菌ddH2O洗滌兩次,然后重懸于10 mL的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.0)中。隨后,取1 mL菌懸液稀釋1000倍倒入無菌培養皿中,配合無菌攪拌子,放置于磁力攪拌器上,將培養皿置于紫外燈下(15 W)照射,照射距離為30 cm,照射時間為0、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s,用移液槍吸取0.1 mL菌懸液于PDA瓊脂培養基上涂布,每個處理使用三個平板,不進行照射(0 s)的菌懸液涂布作為空白對照;處理后立即用紙包裹,避光倒置,28 ℃下培養72 h。通過統計平板上菌落的數量,根據公式存活率(%)=Y/X×100,其中:X為對照組的菌落數平均值,Y為誘變處理組的菌落數平均值,計算誘變存活率,并確定最適誘變條件。同時,對出發菌及存活株進行多次誘變處理,利用顯微鏡觀察誘變株的菌體形態。

1.2.2 GS的選育 GS的方法參照參考文獻[20]。將在紫外誘變中篩選出的優良菌種As.302、As.406、As.401活化至對數期,向菌液中加入1%的預處理溶液搖床培養1 h,離心收集菌體并用高滲緩沖液洗滌兩次,隨后用等體積高滲緩沖液重懸,控制菌懸液菌體濃度在108cfu/mL左右。接下來向菌懸液中加入2 mg/mL的溶菌酶,28 ℃水浴酶解1～2 h,離心收集菌體,經高滲穩定液洗滌2次并重懸于高滲穩定液中。將上述原生質體懸浮液兩兩等量混合,55 ℃水浴熱滅活處理120 min,在35%的PEG4000介導下進行全基因組隨機改組。每一輪GS結束后,選擇普魯蘭多糖產量增加最明顯及產物較明亮的改組菌進行發酵,每株菌三個平行。根據發酵實驗結果,篩選出性狀優良的三株菌作為下一輪GS的出發菌株。

1.2.3 突變株的篩選

1.2.3.1 初篩 將未經誘變的菌體和突變株或融合株制成菌懸液,分兩組,分別稀釋到同樣的倍數,涂布于含有0.05%曲利苯藍的雙層再生培養基,28 ℃倒置培養72 h,以未經誘變的一組為對照。挑取平板上菌落直徑大,顏色深,表面濕潤的變異株。

1.2.3.2 復篩 將初篩后的菌株接種到種子培養基并轉接到發酵培養基中,28 ℃、200 r/min搖瓶發酵培養96 h,選出多糖含量明顯提高且色素明顯減少的1～2株。

1.2.4 普魯蘭多糖的測定 向15 mL發酵上清液中添加2倍體積的95%乙醇,4 ℃靜置過夜,5000 r/min離心15 min,沉淀物用無水乙醇洗滌兩次,將沉淀于70 ℃烘至恒重,稱量記錄[21]。多糖含量計算公式:

多糖含量(g/L)=(M實重-M空重)×1000/15

其中:M空重為烘至恒重稱量瓶的重量(g),M實重為烘至恒重多糖和稱量瓶的重量(g)。

1.2.5 紅外光譜檢測(FT-IR) 取普魯蘭多糖標準品與干燥的多糖沉淀樣品1～2 mg分別置于瑪瑙研磨體中,加入干燥的溴化鉀粉末100～200 mg混合均勻,置于不銹鋼磨具中抽真空后,用壓片機進行壓片處理,壓好的薄片置于傅里葉紅外光譜儀中進行紅外掃描處理。隨后,將得到的樣品的紅外光譜數據與普魯蘭多糖標準品進行比對,具體方法參照文獻[22]。

1.3數據處理

數據采用Origin 8.6處理和Adobe Illustrator CS5作圖。

2 結果與討論

2.1親本突變庫的構建

為了達到更好的育種效果,研究者往往通過誘變處理出發菌株,并以篩選到的正突變株作為GS的出發菌株[23]。本研究以A.pullulansAs.40329和As.3#為出發菌株,采用紫外誘變處理以建立改良的親本突變庫。在存活率為20%～30%時,正突變幾率更高[24],由紫外誘變存活率結果(圖1)可知,As.40329選擇紫外線誘變時間為180 s,此時存活率為28.4%,As.3#選擇紫外誘變時間為150 s,存活率為19.7%。

圖1 紫外誘變存活曲線

經初篩、復篩后,獲得As. 301～As. 305,As. 401～As. 407共12株多糖產量較高且色素較少的親本突變株。其中,以As. 3#為親本得到的突變株As. 302的多糖產量為(14.28±0.36) g/L,以As. 40329為親本獲得的突變株As. 401和As. 406的多糖產量分別為(9.18±0.2) g/L和(19.57±0.42) g/L(圖2)。進一步對As. 302、As. 401和As. 406三株菌的發酵產物及相應的菌體形態進行分析,結果如圖3所示,As. 302產物黑色素含量低于As. 406,且與As. 406相比,As. 302產孢子能力較低。值得注意的是,As. 401多糖產物黑色素含量較低,菌體形態鏡檢結果顯示,其呈現較明顯的類酵母形態。這個結果可能與Li等[25]的報道類似,他們發現新分離的A.pullulansNG的細胞形態及產物普魯蘭多糖中是否含有黑色素,與培養基的pH及氮源含量不同所導致的細胞形態差異有關。綜上,選擇誘變株中兩個多糖產量最高的As. 302和As. 406,以及多糖產物黑色素產量低的誘變株As. 401進行后續的GS。

圖2 A. pullulans紫外誘變突變株發酵產多糖情況

圖3 普魯蘭多糖(A)和出芽短梗霉細胞形態(B)

2.2A.pullulans的GS選育

將紫外誘變獲得的As. 302、As. 406及As. 401進行首輪基因組改組。由于曲利苯藍與多糖分子進行結合后會生成藍色復合物,且其顏色的深淺與多糖含量呈現正相關關系[26]。因此,可以通過觀察改組菌的菌落大小、顏色來衡量改組菌的多糖生產能力。本研究中,通過曲利苯藍平板初篩,選出了7株原生質體較大且顏色較深的菌株,分別命名為F1-1～F1-7,并對這7株菌株進行發酵驗證,結果見圖4。其中,F1-2多糖產量達到(20.75±0.45) g/L,其多糖產物為墨綠色;F1-6所產多糖呈淺黃白色,產量為(16.75±0.41) g/L;F1-7所產多糖近乎為純白色,產量達到(15.86±0.40) g/L。通過綜合對比F1-1～F1-7的發酵性能及產物特征,選擇F1-2、F1-6及F1-7作為下一輪GS的出發菌株。

通過新一輪的GS,利用與上輪相同的方法進行初篩,獲得了F2-1～F2-7共7株改組菌。發酵結果表明,F2-6多糖產物為純白色,多糖產量達到(19.53±0.39) g/L,相較于無色素出發菌As.401和淺色原始菌As.3#,其多糖產量分別提高了112.75%、119.69%(圖4)。在接下來的研究中,又進行了多輪GS,但改組菌生產無黑色素多糖的能力并未超過F2-6。因此,確定F2-6為獲得的目的菌株。

2.3F2-6的發酵驗證

由圖5可知,在2%的接種條件下,菌株F2-6在發酵培養基中的生長并未呈現明顯的停滯,其生物量在0～60 h快速增長,60 h之后菌體進入穩定期,生物量最高為(20.42±0.69) g/L。在搖瓶培養的前60 h,多糖產量無明顯增加,但在60～96 h內迅速上升,96 h時達到最高產量(19.55±0.79) g/L。由于OD654值通常用來評估發酵液的顏色變化,以空白發酵液為對照,用以表征發酵液中黑色素的積累[14]。在整個發酵過程中,發酵液的OD654值一直維持在0.02左右,表明發酵液中無明顯黑色素積累。同時,根據菌體F2-6的生物量和普魯蘭多糖產量綜合確定最適發酵時間為96 h。

表1 菌株F2-6的遺傳穩定性

圖4 A. pullulans的全基因重組后普魯蘭糖的產量

圖5 出芽短梗霉F2-6的發酵實驗結果

為考察改組菌的遺傳穩定性,對獲得的高產無色素普魯蘭多糖菌株F2-6進行傳代分析,表1結果表明,經過8代多糖產量浮動較小,說明菌株F2-6的遺傳性狀較為穩定,并未出現大幅度降低。

2.4多糖產物的紅外光譜分析

為考察產品是否為普魯蘭多糖,對普魯蘭多糖標準品和F2-6發酵提取的粗多糖進行了紅外光譜分析,結果見圖6。在普魯蘭多糖的特征吸收區域(1750～750 cm-1),二者顯示出相似的吸收特征,表明F2-6發酵產生的多糖與標準品普魯蘭多糖呈現相同或相似的化學結構。其中,3500～3200 cm-1的吸收為O-H的伸縮振動,與樣品的含水量有關[27]。

圖6 普魯蘭多糖紅外光譜圖

3 結論與討論

本文以A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#為出發菌株,獲得了As. 302、As. 406及As. 401三株親本正突變株。隨后,對三株親本制備原生質體并采用35% PEG4000介導進行了兩輪全基因改組后,成功選育出一株高產普魯蘭糖且幾乎不產黑色素的菌株F2-6。菌株F2-6能夠較為穩定的遺傳,在發酵培養基中發酵96 h后,普魯蘭多糖產量達到(19.53±0.39) g/L,比黑色素積累能力弱的原始菌As.3#提高了119.69%。與萬翠香[14]等人的報導相比,菌株F2-6的普魯蘭多糖的產量相對偏低,但其OD654維持在0.02左右,低于報道值。本研究為高產無黑色素普魯蘭多糖的出芽短桿霉工業生產候選菌株的育種提供了一種快速可行的方式,也為其他工業生產菌株的育種提供借鑒。

隨著A.pullulansAY4全基因組的公布[28],加強對其功能解析及操作系統構建方面的研究,進而從全細胞角度對A.pullulans進行無抗性代謝途徑改造,將有助于提高A.pullulans的普魯蘭多糖產量。同時,利用轉錄組學、蛋白質組學及生物信息學等技術對比出發菌與無黑色素積累能力的改組菌之間的全細胞水平表達差異,將有助于從分子層面揭示黑色素在A.pullulans體內的形成機理。

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Breedingofapigment-freepullulanproductionmutantstrainofAureobasidiumpullulans

ZHANGRuo-xuan1,SUNShuai-nan1,SUNQin-ju1,LIUXin1,HANGFang-xue1,2,LIUJi-dong1,2,*

(1.Light Industry and Food Engineering Institute of Guangxi University,Nanning 530004,China;2.Guangxi Sugar Industry Collaborative Innovation Center,Nanning 530004,China)

To screen anAureobasidiumpullulansthat could be used for the production of pigment-free pullulan,A.pullulansAs.40329 andA.pullulansAs.3# were used as hosts in the present study. Three positive mutants were obtained as parents after ultraviolet(15 W)induced mutation of the two hosts,followed with genome shuffling(GS)that mediated by 35% PEG 4000,and a s

TableA.pullulansstrain F2-6 was obtained after parental inactivation. Nearly no pigment was detected in the culture ofA.pullulansF2-6,and pullulan production reached to(19.53±0.39) g/L,119.69% higher than that ofA.pullulansAs.3#. The results indicated thatA.pullulansF2-6 could be used as a potential strain in industrial production process.

Aureobasidiumpullulans;pullulan;genome shuffling;pigment

2017-04-25

張若璇(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：應用微生物學，E-mail：genus_rosa@163.com。

*

劉繼棟(1980-)，男，博士，講師，研究方向：應用微生物學，E-mail：liujd@gxu.edu.cn。

國家自然科學基金(31460026)；廣西壯族自治區教育廳科研(重點)項目基金(ZD2014001)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)22-0109-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.022