宮頸癌及癌前病變中的HPV-16整合人宿主基因組的發生情況及其在宮頸癌篩查中的應用

王 霞

(陜西省榆林市中醫院北方醫院病理科， 陜西 榆林 719000)

宮頸癌及癌前病變中的HPV-16整合人宿主基因組的發生情況及其在宮頸癌篩查中的應用

王 霞

(陜西省榆林市中醫院北方醫院病理科， 陜西 榆林719000)

目的探討人類乳頭瘤病毒16型(HPV-16)在宮頸癌及宮頸癌前病變患者中與宿主基因組的整合情況。方法選取宮頸癌變組織252例，其中48例為宮頸癌組織，204例為宮頸上皮內瘤樣病變組織(CIN)，其中包括125例CIN Ⅰ,46例CIN Ⅱ，33例CIN Ⅲ作為研究組；另外選取20例因子宮肌瘤行全子宮切除術的正常宮頸上皮組織作為對照組。對各標本采用定量PCR檢測法檢測HPV-16病毒的整合狀態。結果與正常的宮頸上皮組織相比，宮頸病變組織均發生了HPV-16病毒感染且與宿主基因整合的情況。其中宮頸癌組織的整合率最高，而CIN組織中隨著病變程度的加重HPV-16病毒的整合率也增高，差異有統計學意義(χ2=49.7359、12.6033，P均<0.01)。結論宮頸病變的嚴重程度可能與HPV-16的整合感染有關，在HPV DNA檢測的基礎上聯合對高危HPV整合感染狀態進行檢測有利于提高宮頸癌篩查準確率并在早期預測宮頸病變的轉歸。

宮頸癌； 癌前病變; 人類乳頭瘤病毒; 整 合

生殖道人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HVP)的感染而誘發女性宮頸癌是目前普遍認可的主要因素[1]。但是據相關流行病學研究結果顯示，僅僅為HPV感染不足以導致發生宮頸癌，而在受到高危型HVP感染且發生HVP病毒與宿主基因組發生整合狀態時，宮頸上皮細胞會發生惡性轉化，從而可能導致宮頸癌的發生。在宿主不同的DNA開放讀碼框架處，HPV均可以在此與宿主基因組發生整合[2,3]。其中，不穩定的E2基因鉸鏈區是高危HVP整合宿主基因組最常見的缺失或斷裂部位[4]。在高危HVP病毒類型中，最常見的就是人類乳頭瘤病毒16型(HVP-16)[5]，本次研究中，采用重疊定量PCR技術探討各宮頸病變組織中HPV-16 E2基因的缺失從而判斷HPV-16與宿主基因組的整合情況，并初步探討HPV-16整合狀態及其與誘發宮頸癌之間的關系和臨床意義。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1宮頸上皮組織的提取:選取2012年2月至2014年12月在我院經活檢，宮頸錐切術及廣泛性全子宮切除術后獲得的宮頸病變組織存檔蠟塊標本252例為研究組，并根據WHO女性生殖道腫瘤組織學分型標準，將標本分別劃分為48例宮頸癌及204例CIN，其中包括CINⅠ125例,CINⅡ46例，CINⅢ33例。另外將同時期因子宮肌瘤于我院行子宮全切術后提取的20例正常宮頸上皮組織作為對照組。所用標本患者均為已婚婦女且在取檢前均未行任何化療或放射治療，年齡為27～68歲，平均年齡46歲。將蠟塊標本進行常規切片和HE染色后顯微鏡下觀察，取細胞無異常的組織切片用于進一步實驗。

1.1.2細胞系在37℃，5%CO2，飽和濕度環境下，將人宮頸癌細胞株SiHa,CasKi(美國生物物種保藏中心)分別培養于10%胎牛血清的DMEM培養液和RPMI培養液中。

1.2方 法

1.2.1提取石蠟切片中的DNA對每塊蠟塊標本中進行1μm厚切片，然后每塊蠟塊各取3片進行下一步試驗。對切片進行脫蠟并分別加入30μL蛋白酶K溶液,30μL 20%SDS和500μL TES溶液，于56℃水浴72h；繼續用酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)抽提2次，然后進行離心并棄去上清液后加入無水乙醇2倍體積和3mol/L的乙酸鈉1/10體積，再次離心后棄上清液并于真空泵中進行沉淀干燥，最后于沉淀中加入少量TE緩沖液進行溶解。完成DNA的提取。

1.2.2HVP-16感染的確定:當在DNA水平和蛋白質水平兩個分子水平上均檢測陽性可以判斷HVP-16感染。①DNA水平確定HVP-16感染：用PCR檢測計算機軟件輔助設計的HVP-16 E7基因以確認為HVP-16感染，設計的HVP-16 E7基因序列為：上游引物5’-AGAAACCCAGCTGTATCAT-3’，下游引物5’-TTATGGTTTCTGAGAAGAGA-3’.②蛋白質水平確定HVP-16感染:采用免疫組化SP法檢測切片組織中HPV-16 E7的表達的蛋白質水平從而確定HPV-16感染，具體步驟參照文獻所述[6]。

1.2.3HVP-16與宿主基因組織整合的確定:采用重疊PCR法分別擴增確認為HVP-16感染標本的HVP-16 E2基因中的三個相互間有序列的的交叉小片段來確定是否存在病毒整合情況，A、B、C三個交叉小片段的引物序列分別如下,見表1。

表1 各片段的引物序列

當片段A,B,C三個不能同時陽性擴增時，提示HVP-16 E2基因存在缺失，從而代表HVP-16與宿主基因組發生了整合。HPV-16發生整合感染僅僅能擴增出C片段，而發生HPV-16的游離感染的標本能擴增出A、B、C、三個片段(以Caski和SiHa細胞株的DNA作為陽性)，見圖1。

63.

圖1 重疊PCR擴增HPV-16 E2不同片段判斷HPV-16整合狀態

M：marker;1:Caski;2:SiHa;3:CIN ;4:CIN ;5，6:Cervical Carcinoma(integrated);7:control

1.2.4統計學方法：應用SPSS10.0統計軟件對文中相關數據進行分析，計量資料采用均數及標準差形式表示，計數資料用率表述，采用χ2檢驗，用秩和檢驗(Wilcoxon)的方法，對等級資料進行檢驗。P<0.05時，差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HVP-16感染確定情況:正常宮頸上皮組織，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的組織中HVP-16感染率為5.0%(1/20)、18.4%(23/125)、36.9%(17/46)、45.5%(15/33)、68.8%(33/48)，對比CINⅡ感染率(36.9%)高于CINⅠ(18.4%)感染率，CINⅢ(45.5%)感染率(45.5%)明顯升高，隨著病變程度的增高感染率也增高，差異有統計學意義(χ2=49.7359，P<0.001)，見表2。

2.2HVP-16與宿主基因組整合的確定:根據重疊PCR擴增HVP-16 E2基因不同片段確定HVP-16整合結果提示，在確定HVP-16感染的標本中，正常宮頸上皮組織標本的結果提示為游離感染，而CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌組織標本的整合例數分別為4、3、5和18例，整合率分別為16.7%(4/24)，18.8%(3/16)，35.7%(5/14)，58.1%(18/31)，宮頸癌整合率58%明顯高于CINⅢ整合率35.7%，同樣CINⅡ整合率18.8%高于CINⅠ16.7%，隨著病變程度的增高整合率也增高，差異有統計學意義(χ2=12.6033，P=0.0056)，見表3。

表2 不同病變程度宮頸上皮組織的HVP-16感染率的比較

表3 不同病變程度宮頸上皮組織的HVP-16整合率的比較

3 討 論

宮頸癌是世界上婦科腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，據相關統計學研究顯示世界上每年約有19萬女性死于宮頸癌，其中超過半數案例是發生在發展中國家。我國每年的宮頸癌病例約為10萬，占世界總發病人數的三分之一[7]，所以宮頸癌嚴重影響著我國女性的生命健康，對此進行的防治工作刻不容緩。

直到目前，有大量的實驗室研究以及流行病學研究結果都證明，HPV病毒的感染是引起宮頸癌發生的最主要因素，并且高危型的HPV病毒持續感染是主要的病因[8，9]。在多種高危型HPV類型中，HPV-16感染是最常見的引起宮頸癌發生的主要類型。本次研究結果顯示，HPV-16感染率隨著宮頸病變程度級別的加重而呈上升趨勢；且HPV-16與宿主基因組的整合率在宮頸癌患者中高達68.8%%，并且隨著宮頸病變程度的加重整合率出現明顯的提高，提示HPV-16感染與宮頸病變程度呈正相關，并且提示宮頸病變發生惡性轉化的過程中HPV-16整合狀態的存在是高危因素。

有研究表明，多數的HPV感染是一過性的，一般病毒會在感染后的6～12各月內消退。但是當在宿主的防御機制發生缺陷或者基因發生突變的時候，HPV病毒的基因片段則會與宿主發生改變的細胞基因組發生相關整合，因而導致細胞的基因調控機制出現失調的情況[10]。若HPV病毒的繁殖停止在復制周期的某一時相，就會發生HVP的持續感染，HPV特別是高危型HPV的持續性及反復性感染可能會導致宮頸細胞發生惡性轉化。有研究認為宮頸組織發生癌變的過程中的早期事件有可能就是HVP與宿主基因組發生整合[11]，但是關于其整合的具體的發生時相目前尚未有統一的結論，還需要進一步的研究討論。目前有研究表示在宿主宮頸病變組織中，HVP并非只是以單純的整合感染的狀態存在，因此HPV-16整合感染與宮頸病變組織惡化之間的相關性以及作用機制還需要進一步的研究。但是HPV-16作為惡化的高危因素，在預測宮頸癌前病變的轉歸上存在著一定預測作用。

HPV DNA檢測方法是目前我國最普遍的宮頸癌初步篩選方法，但是僅僅檢測是否存在HPV感染，不能發現HVP是否與宿主基因組發生了整合感染而且其特異度低、浪費衛生資源，還會給婦女帶來一些不必要的身心傷害。在本次研究中，在CIN發生HPV-16感染的病例中就有22.3%發生HPV-16整合，即使在CIN I中整合率就有16.7%，說明高危HPV整合在宮頸病變的發生的早期中就有整合并且貫穿整個癌變過程。因此采用簡單、快速的HPV DNA檢測合高危HPV整合狀態的檢測，能夠提高宮頸癌初步篩選特異度以及陽性預測值。

綜上所述，HPV-16的整合感染可能導致宮頸病變惡化，在HPV DNA檢測的基礎上聯合對高危HPV整合感染狀態進行檢測有利于提高宮頸癌篩查特異度并在早期預測宮頸病變的轉歸

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IntegratedStateofHPV-16inPrecancerousTissuesandCervicalCancerandApplicationinCervicalCancerScreening

WANGXia

(TheNorthernHospitalofYulinHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShaanxiYulin719000,China)

Objective：To investigate the prevalence of physical state of HVP-16 DNA in cervical and cervical precancerous carcinoma.MethodMultiplex PCR was adopted to detect the physical state of HPV in samples from 252 patients with cervical carcinoma, including 48 samples of cervical cancer, 204 cervical intraepithelial(CIN)(125 CIN I,46 CIN Ⅱ and 33 CIN Ⅲ)and 20 normal samples from the subjects with hysteromyoma undergoing hysterectomy ,respectively.ResultNot only patients with cervical cancer but also patients with precancerous were found to have integrated infection with HPV-16 and those with cervical cancer have the highest integration rate. With the elevating of the grades of CIN, the integrated infection rates of HVP-16 was significantly elevated, the difference was statistically significant (χ2=49.7359,12.6033, P<0.01).ConclusionAmong the patients with HPV-16 infection,the integrated state of HVP-16 is positively correlated with the severity of cervical lesions. Combined HVP typing test and detection of integrated viral contribute to predicting the prognosis of patients with cervical precancerous lesions and increasing the accuracy of screening cervical cancer on the basis of HPV DNA detection.

Cervical cancer; Precancerous tissues; Human papillomavirus; Integration

1006-6233(2017)11-1768-05

陜西省科技攻關項目，(編號：201205319)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.11.003