實時熒光定量PCR方法檢測轉基因玉米MIR604

常麗娟，宋 君，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川 成都 610066)

實時熒光定量PCR方法檢測轉基因玉米MIR604

常麗娟，宋 君*，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川 成都 610066)

轉基因玉米MIR604是瑞士先正達公司2005年研發(fā)的抗蟲玉米，中國于2008年批準MIR604進口作為食品和飼料的加工原料。為了精確定量檢測MIR604及其加工產(chǎn)品，在MIR604的左側邊界序列和玉米基因組之間設計引物和探針，成功建立了MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法。采用該方法設計的引物和探針，對6種非轉基因作物、MIR604及其他非目標轉基因作物進行檢測，除MIR604外，其余樣品均未檢測到MIR604分子片段的擴增信號；對已知含量為1%的MIR604標準品進行定量檢測，測量值為1.07%，接近真實值1%；靈敏度實驗結果顯示，該方法能檢測到僅5個拷貝的MIR604分子片段。該試驗所建立的MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法具有較高的特異性、準確度及靈敏度，可用于轉基因玉米MIR604的定量檢測。

轉基因玉米MIR604；實時熒光定量PCR；特異性；準確度；靈敏度

轉基因作物在全球快速發(fā)展，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織(ISAAA)發(fā)布的一份報告，轉基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2上升至2015年的1.797億hm2，種植的轉基因品種包括轉基因大豆、玉米、棉花和油菜，其中玉米是獲得商業(yè)種植批準最多的轉基因作物。James等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球有超過120個轉基因玉米品種在二十多個國家被批準可作為食品和飼料的加工原料。轉基因玉米MIR604是轉入蘇云金芽孢桿菌Cry3A基因的抗蟲玉米，由該基因編碼的毒素蛋白由3個不連續(xù)的結構域組成，對鞘翅目昆蟲具有特異毒性[2]。自2007年起，MIR604先后在美國、菲律賓、俄羅斯、韓國和日本等多個國家被批準可進口作為食品和飼料的加工原料。我國于2008年批準MIR604進口作為食品和飼料的加工原料。MIR604進入中國市場后，按照我國轉基因標識管理辦法規(guī)定，MIR604及其加工產(chǎn)品必須進行標識。目前，我國轉基因生物安全檢測體系中只有MIR604及其加工產(chǎn)品的定性檢測標準[3]，尚無相關的定量檢測標準。國際上歐盟曾經(jīng)發(fā)布過基于TaqMan探針的實時熒光定量PCR檢測標準[4]，但國內(nèi)尚未對該標準進行確證。為了精確定量MIR604，本試驗建立了MIR604品系特異實時熒光定量PCR檢測方法，為我國轉基因玉米安全監(jiān)管提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實驗所用的含量為1%和10%的MIR604標準物質(zhì)(Certified Reference Material，CRM)及其他轉基因作物粉末材料均購自歐盟聯(lián)合研究中心測量與標準物質(zhì)研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre (JRC)，Belgium)；實驗所用的非轉基因作物材料由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器

實驗所用的植物基因組DNA純化試劑和實時聚合酶鏈式反應試劑(Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Master Mix)，購自TIANGEN?天根生化科技(北京)有限公司。實驗所用的主要儀器有超微量分光光度計(Nanodrop?1000， Thermo Fisher Scientific Corporation)和實時熒光PCR系統(tǒng)(Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的分離與純化

按照植物基因組DNA純化試劑盒(TIANGEN?，天根生化科技(北京)有限公司)說明書分離、純化基因組DNA。

1.2.2 引物和探針設計

玉米內(nèi)標基因zSSⅡb采用國家標準GB19495.4—2004中的引物和探針序列[5]，通過查詢MIR604的載體和旁側序列信息(http://www.shgmo.org/welcome.htm)，應用 Primer Express 3.0 在左側邊界序列和玉米基因組連接處設計定量 PCR引物和探針，所有引物與探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 反應體系及條件

將DNA稀釋到50 ng·μL-1，取4 μL DNA加入到20 μL反應體系：TaqMan Master mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，探針(10 μmol·L-1)0.5 μL，補水至20 μL。運行如下程序：95 ℃預變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，45個循環(huán)。

1.2.4 方法的特異性、準確度和靈敏度

采用本方法對非轉基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個轉基因玉米59122、DAS-40278-9、3272、Mon863、Mon810、Mon88017、Bt11、Bt176、NK603、TC1507、T25、GA21、MIR162、MIR604、98140，5個轉基因水稻TT51-1、科豐2號、科豐6號、克螟稻5、M12，5個轉基因大豆GTS40-3-2、Mon87701、Mon87708、A5547-127、A2704-12，5個轉基因棉花Mon1445、Mon15985、Mon531、LLcotton25、GHB614，6個轉基因油菜GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3和1個轉基因甜菜H7-1進行了特異性檢測，確定本方法的特異性。

分別提取1%和10%的轉基因玉米MIR604基因組DNA，將10% MIR604基因組DNA按照1∶5梯度稀釋成42.00、8.40、1.68、0.34、0.07 ng 5個梯度作為標準曲線，以1%MIR604基因組DNA為檢測樣品進行定量檢測，檢測樣品重復10次擴增反應，計算1%MIR604標準物質(zhì)的測量值。

將轉基因玉米MIR604的基因組DNA按照1∶2梯度稀釋成0.184、0.092、0.046、0.023、0.012 ng 5個梯度，每個梯度重復8次擴增反應。根據(jù)玉米基因組大小，計算出每個梯度反應體系中MIR604分子片段的拷貝數(shù)(copies)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 引物和探針設計

轉基因玉米MIR604的T-DNA插入序列(圖1)含有2個外源基因表達盒(gene expression cassette)，一個是包含MTL啟動子、Cry3A編碼基因和tNOS終止子的基因表達盒，另一個是包含ZmUbiInt 啟動子、pmi編碼基因和tNOS終止子的基因表達盒。應用 Primer Express 3.0 在左側邊界序列和玉米基因組連接處設計定量 PCR引物和探針(表1)，擴增產(chǎn)物長度為124 bp。

箭頭代表引物與探針的設計位置和方向The arrows show the location and orientation of primers and probes圖1 MIR604 外源載體結構示意圖(A)和MIR6043′端旁側序列(B)Fig.1 Schematic diagrams of the inserted T-DNA region of gene construct for genetically modified maize MIR604 (A) and the sequences flanking the 3′ of the T-DNA in genetically modified maize MIR604 (B)

表1轉基因玉米MIR604定量檢測的引物和探針

Table1The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

基因名稱Genename引物和探針序列Sequenceofprimersandprobes擴增產(chǎn)物長度Lengthofamplificationproducts/bp內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡbzSSⅡb-F:5'-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'zSSⅡb-R:5'-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'zSSⅡb-P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAM-RA-3'151MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR604Eve-F:5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’Eve-R:5’-CGACGCTTGCGCGAG-3’Eve-P:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMARA-3’124

2.2 方法的特異性

采用本方法設計的引物和探針對6種非轉基因作物、MIR604及其他非目標轉基因作物進行檢測，只有MIR604檢測到擴增信號(圖2)，其他非轉基因作物和非目標轉基因作物均未檢測到擴增信號，顯示本試驗建立的檢測方法具有很高的特異性。

2.3 方法的準確度

將10%的MIR604標準物質(zhì)DNA等比稀釋建立標準曲線，玉米內(nèi)源基因zSSⅡb的標準曲線方程為Y=-3.45X+31.97，相關系數(shù)R2為0.998，擴增效率為95.00%；MIR604分子片段的標準曲線方程為Y=-3.31X+33.76(圖3)，相關系數(shù)R2為0.996，擴增效率為100.10%。采用本方法對已知濃度為1%的MIR604標準物質(zhì)進行定量檢測，測試樣品平均相對含量為1.07%(表2)，測量值與真實值的相對偏差為7%，說明該方法具有較高的準確度[6]。

S型曲線為轉基因玉米MIR604的擴增曲線；水平直線為非轉基因作物及其他非目標轉基因作物的擴增曲線The S-liked curve presented the amplification of genetically modified maize MIR604 and the horizontal straight line indicated the amplification of non-genetically modified crops and other non-target transgenic crops圖2 轉基因玉米MIR604擴增的特異性Fig.2 The specialty of amplification of genetically modified maize MIR604

表2檢測樣品(1%，CRM)轉基因玉米MIR604結構特異片段定量檢測結果

Table2Quantitative detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

分子片段MolecularfragmentCt值平均值MeanofCtvalueCt值標準偏差SDCt值相對標準偏差RSD/%絕對含量平均值Meanofabsolutecontent絕對含量標準偏差SD絕對含量相對標準偏差RSD/%測量值Measuredvalues/%偏差Biase/%MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR60431.9840.0470.1473.4580.1133.2681.077內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡb23.3280.1200.514321.44225.0407.790

A， MIR604品系特異性定量PCR擴增曲線；B， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR擴增曲線；C， MIR604品系特異性定量PCR標準曲線；D， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR標準曲線。

A， The amplification curve for the MIR604 event-specific assay; B， The amplification curve for thezSSIIb; C， The standard curve for the MIR604 event-specific assay; D， The standard curve for thezSSIIb gene assay.

圖3 品系特異性定量PCR方法的擴增曲線和標準曲線Fig.3 The amplification and standard curves for the event-specific quantitative PCR method

2.4 方法的靈敏度

為了確認方法的靈敏度，分別以不同拷貝數(shù)的DNA為模板進行實時擴增，8次重復都有擴增信號的最低外源片段分子拷貝數(shù)為本方法的檢測下限。結果(表3)表明，本方法最低能檢測到0.012 ng的MIR604分子片段，平均Ct值為39.356。經(jīng)計算檢測下限約為5個拷貝的MIR604核酸分子片段。

表3轉基因玉米MIR604結構特異片段靈敏度檢測結果

Table3The sensitive detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

DNA的量AmountofDNA/ng外源片段分子拷貝數(shù)CopiesofexogenousmolecularfragmentsCt值平均值MeanofCtvalue標準偏差SD相對標準偏差RSD/%0.1848034.9610.2100.6010.0924036.0970.3070.8500.0462037.2280.3440.9240.0231038.4220.4011.0440.012539.3560.2250.572

3 討論

以PCR技術為基礎的轉基因成分檢測根據(jù)PCR引物設計位點不同，可分為篩查法、基因特異性方法、結構特異性方法和品系特異性方法。品系特異性方法引物設計通常在外源載體和受體植物基因組分別設計上下游引物，可以區(qū)分相同轉化載體的不同轉化事件，同時鑒定出外源載體結構和受體植物品種，因此品系特異性方法應用廣泛。常見的轉基因水稻品種TT51-1、科豐6號[7-8]，轉基因玉米品種NK603、MON863、98140、MIR612[9-12]，轉基因油菜品種GT73[13]等都已研發(fā)了相應的品系特異性方法。轉基因玉米MIR604投放市場后，歐盟、日本和韓國先后建立了本國MIR604實時熒光定量PCR檢測方法，并且歐盟在此基礎上建立起了MIR604熒光定量檢測標準。日本和韓國科學家[14-15]建立了MIR604品系特異熒光定量檢測方法，準確度方面日本科學家不同濃度的MIR604定量檢測結果偏差在20%～40%，韓國科學家檢測結果偏差在0～9%。靈敏度方面日本科學家建立方法的檢測下限為0.5%，韓國科學家建立方法的檢測下限為0.1%。目前，我國尚無MIR604的定量檢測標準，本試驗建立的MIR604品系特異性定量檢測方法在左側邊界序列和玉米基因組連接處設計定量 PCR引物和探針，對6類非轉基因作物和常見非目標轉基因作物均無非特異擴增，具有較好的特異性。采用該方法所建立的標準曲線斜率在-3.6～-3.1，擴增效率在90%～110%，相關系數(shù)大于0.99，待檢樣品的定量檢測結果為1.07%，檢測結果的偏差為7%，符合歐盟熒光定量準確度相關標準[16]。參照我國農(nóng)業(yè)部行業(yè)現(xiàn)有定量標準[17]，將檢測下限換算為外源片段的拷貝數(shù)，本方法最低能檢測到含量為5個拷貝的MIR604分子片段，具有較好的靈敏度。因此，本試驗所建立的轉基因玉米MIR604品系特異性實時熒光定量PCR檢測方法可以在檢測工作中推廣應用。

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(責任編輯張 韻)

Areal-timefluorescentquantitativePCRfordetectionofgeneticallymodifiedmaizelineMIR604

CHANG Lijuan， SONG Jun*， ZHANG Fuli， LIU Wenjuan， TANG Chunyan， WANG Dong， YIN Quan

(AnalysisandTestCenter，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，Chengdu610066，China)

Genetically modified maize MIR604 is an insect resistant maize line developed by Syngenta in 2005， which was approved as a raw material for food and feed processing in 2008 in China. In order to accurately detect MIR604 and its processing products， event-specific quantitative PCR detection method was established in this study. The PCR primers and probes were designed specially according to the left boundary sequence of MIR604 and maize genome sequence. Finally， we used the method to detect 6 kinds of non-genetically modified crops， MIR604 and other non-target transgenic crops. The results showed that the other samples apart from MIR604 were not detected. The measured value of the sample(CRM) containing 1% MIR604 was 1.07%， which was close to the real value (1%). The sensitivity experiment results indicated the method could detect only 5 copies of MIR604 molecular fragments. Thus， the event-specific quantitative PCR detection method of genetically modified maize MIR604 has high specificity， accuracy and sensitivity， which can be used for quantitative detection of genetically modified maize MIR604.

genetically modified maize MIR604; real-time fluorescent quantitative PCR; specificity; accuracy; sensitivity

常麗娟，宋君，張富麗，等. 實時熒光定量PCR方法檢測轉基因玉米MIR604[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(11)： 1769-1774.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.01

2017-04-07

四川省質(zhì)監(jiān)局標準化技術體系(ZYBZ2013-39)

常麗娟(1982—)，女，四川巴中人，碩士，助理研究員，從事轉基因生物安全監(jiān)管研究。E-mail: juanjuanclj@126.com

*通信作者，宋君，E-mail: drsjn@126.com

S513

A

1004-1524(2017)11-1769-06