柯里拉京與DNA相互作用的光譜研究

申炳俊， 劉占偉, 劉榮娟, 張佳佳, 林曉倩, 田 堅, 金麗虹*

(1. 長春理工大學 清潔能源技術研究所， 吉林 長春 130022; 2. 長春理工大學 生命科學技術學院， 吉林 長春 130022)

柯里拉京與DNA相互作用的光譜研究

申炳俊1， 劉占偉2, 劉榮娟2, 張佳佳2, 林曉倩2, 田 堅1, 金麗虹2*

(1. 長春理工大學 清潔能源技術研究所， 吉林 長春 130022; 2. 長春理工大學 生命科學技術學院， 吉林 長春 130022)

在pH 7.4的生理條件下，以溴化乙錠(EB)作為熒光探針，利用熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、共振散射光譜法結合鹽效應和DNA熔點(Tm)實驗研究了柯里拉京(Cor)與小牛胸腺DNA分子之間的相互作用機制。實驗結果表明，Cor靜態猝滅DNA-EB體系的熒光。Cor與DNA作用后，其特征吸收峰強度發生減色效應；與DNA作用導致Cor在480.5 nm處的共振散射峰增強，并在330.2 nm處出現新共振散射峰。鹽效應對Cor與DNA分子相互作用的影響較小。與Cor作用引起DNA的Tm值升高5.5 ℃。由此推斷，Cor與DNA相互作用的主要方式為嵌插，兩者間形成了超分子體系。通過計算獲得Cor與DNA間結合常數(KA)為5.82×103L/mol (298 K)、2.47×104L/mol (310 K)，它們之間的作用為熵驅動的自發、吸熱過程，疏水作用力是主要的非共價作用方式。

柯里拉京； 小牛胸腺DNA； 光譜學； 嵌插； 反應機理

1 引 言

柯里拉京(Corilagin，Cor)又名鞣云實精(或柯子次鞣素)，屬于一種天然的多酚單寧酸類化合物，是葉下珠、老鸛草、蜜柑草、白三草等多種植物的有效成分。1951年，Schmidt等[1]率先從植物薄葉云實中分離得到Cor，但在隨后的30多年里，人們并沒有注意到Cor的藥理活性。直到1985年，Kakiuchi等[2]偶然發現Cor對AMV逆轉錄酶有抑制作用，進而引發了人們對Cor藥理活性的研究。藥理學實驗證明，Cor具有護肝、抗炎、抑制病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，尤其在抗腫瘤、抗氧化方面藥效良好[3-5]。研究表明，Cor對肝癌、卵巢癌、結腸癌、胰腺癌、宮頸癌、胃腺癌、喉癌、鼻腔癌等多種人源或鼠源癌細胞具有很好的抑制作用[6-8]。Cor表現出的多種生物活性及優異的抗癌活性，使其具有重要藥用價值和廣闊市場前景。

DNA是基因表達的物質基礎，亦是多種具有抗癌、抗病毒等活性的藥物小分子在生物體內的主要靶點，藥物小分子與DNA插入方式可能會抑制腫瘤細胞的復制，最終導致細胞凋亡或死亡[9]。因此，研究藥物小分子與DNA間的作用機制，不僅有助于進一步了解其藥物作用機制，還可為尋求新型高效低毒抗腫瘤藥物提供導向。目前，有關Cor抗腫瘤分子機理研究，主要從誘導凋亡[7,10]、阻斷細胞周期[6]、抑制腫瘤發生[2]及增強腫瘤化療藥物的藥效等[11]方面開展。而從Cor與DNA相互作用機制方面研究Cor抗腫瘤機理還鮮見報道。

基于此，本文以Cor為研究對象，在生理條件(pH7.4，離子強度0.1mol/L)下，采用紫外-可見光譜法、熒光光譜法和共振散射光譜法等技術，結合離子強度和DNA熔點實驗，從分子水平上探索Cor與DNA作用機理，揭示Cor對DNA結構的作用強度和影響程度，為在單分子水平上研究Cor抗腫瘤機理提供了重要實驗依據。

2 實 驗

2.1儀器和試劑

實驗中使用的儀器主要有UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司)、F-280熒光分光光度計(天津港東公司)、320pH計(上海梅特勒-托利多儀器公司)、DC-4006高精度恒溫水浴(上海菁海儀器公司)和QL-901振蕩器(江蘇其林貝爾儀器公司)等。小牛胸腺DNA(Sigma公司)用pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液配成濃度為4.9×10-4mol/L DNA儲備液。柯里拉京(Cor，成都普菲德公司)用無水乙醇配成濃度為1.0×10-4mol/L溶液。溴化乙錠(EB，Sigma公司)用二次蒸餾水配成濃度為3.0×10-5mol/L溶液。儲備液置于4℃冰箱中保存。實驗用水為二次去離子水，其他試劑均為分析純。

2.2實驗方法

2.2.1吸收光譜

取6支7mL比色管，分別加入600μL Cor溶液和不同體積的DNA溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至3mL，漩渦充分混合，在室溫下作用30min后分析。以相應濃度的DNA溶液為參比液，掃描200～550nm范圍內的Cor-DNA體系吸收光譜。以緩沖溶液為參比液，獲得1.5×10-5mol/L DNA溶液吸收光譜。

2.2.2熒光光譜

在7mL比色管中加入DNA-EB(濃度比1∶8.3)溶液，充分混合后，在恒溫水浴(298K,310K)中作用30min，完成EB與DNA的結合作用。向DNA-EB體系中依次加入不同體積的Cor溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容，獲得Cor-DNA-EB三元體系。旋渦振蕩后，繼續在恒溫水浴中作用30min，掃描熒光發射光譜。設定激發波長(λex)為488nm，激發(Eex)/發射狹縫(Eem)為10nm/5nm，發射波長范圍為570～640nm。

2.2.3共振散射光譜測定

在同步掃描模式下，記錄Cor和Cor-DNA體系共振散射光譜。設定Δλ=0(λem=λex)，激發/發射波長均為200～700nm，狹縫設定同熒光發射光譜。

2.2.4離子強度影響

向DNA-EB、Cor-DNA-EB兩體系中分別加入不同體積的1.0mol/L的NaCl溶液，記錄NaCl不同濃度時的熒光發射光譜，參數同前。

2.2.5DNA熔點影響

將DNA和DNA-Cor(濃度比1∶2.4)兩體系放置于20～95℃下10min，迅速取出測量260nm處的吸光度。兩體系參比液分別為緩沖溶液和相應濃度的Cor溶液，溫度間隔為5℃。

3 結果與討論

3.1紫外-可見吸收光譜法研究Cor與DNA的作用

1～6:cDNA=(0,2.9,5.1,11.0,16.0,22.0)×10-6mol/L,cCor=2.0×10-5mol/L,7:cDNA=1.5×10-5mol/L

圖1DNA濃度對Cor的紫外-可見吸收光譜的影響

Fig.1Effect of the concentration of DNA on UV-Vis spectra of Cor

3.2熒光光譜法研究Cor與DNA的作用

Cor無熒光特性，而DNA的熒光很弱，因此無法通過測定Cor或DNA的內源熒光來獲得它們之間的相互作用信息。溴化乙錠(EB)是一種熒光染色劑，在水中熒光很弱。當EB菲錠環平行地插入到DNA雙螺旋堿基對之間區域后，其熒光強度大大增加，因而EB是DNA嵌入結合常用的熒光探劑[14]。以488nm為激發波長，測得DNA-EB體系熒光發射峰位于601nm處，如圖2所示。濃度逐漸增加的Cor引起DNA-EB體系熒光發射峰強度逐漸降低，而對峰位和峰形幾乎沒有影響。這說明Cor能夠猝滅DNA-EB體系的熒光，Cor與EB競爭和DNA結合，嵌入到DNA中的EB逐漸被Cor置換出來，進而導致DNA-EB體系熒光減弱。因此，可以推斷Cor以嵌入方式與DNA發生結合。

cDNA=1.5×10-5mol/L,cEB=1.8×10-6mol/L,1～10:cCor=(0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,14.0,18.0,23.0)×10-6mol/L

圖2Cor對DNA-EB體系的熒光光譜的影響

Fig.2Effects of Cor on the fluorescence spectra of EB-ctDNA(T=298K,λex=488nm)

3.2.1熒光猝滅方式及結合常數確定

Cor引起DNA-EB體系的熒光強度降低的原因主要有：(1) Cor與EB間發生了結合作用；(2) 嵌入到DNA中EB被Cor競爭從雙螺旋結構中擠出，Cor與DNA間形成了復合物，產生靜態猝滅；(3) Cor以動態猝滅方式引起DNA-EB體系熒光強度下降。為了明確Cor與EB間是否存在相互作用，文中進行了Cor猝滅EB熒光光譜實驗，Cor的加入對EB熒光強度和發射峰位幾乎沒有影響，說明Cor與EB間沒有結合作用。

無論是動態猝滅還是靜態猝滅，其熒光強度均遵循Stern-Volmer方程[15]：

(1)

式中，F0、F分別為Cor加入前后DNA-EB體系的熒光強度；Kq為雙分子碰撞過程的速率常數；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命(τ0≈1×10-8s)；[Q]為猝滅劑平衡濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數。結果列于表1中。由表1可知，KSV值隨溫度的升高而降低，且Kq的數量級為1012，遠大于2×1010L/ (mol·s)[16](最大碰撞速率常數)，說明Cor對DNA-EB熒光強度的猝滅過程為靜態猝滅。

由Lineweacer-Burk雙對數方程 (lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q])[17]求得結合常數KA和結合位點數n，結果列于表1。Cor與DNA-EB的KA數量級為103～104，說明結合力適中。另外，KA隨溫度升高而增大，表明Cor與DNA的結合過程為吸熱反應。

表1 Cor與DNA-EB作用的猝滅常數KSV、結合常數KA、結合位點數n和熱力學參數

3.2.2 熱力學參數的測定

小分子與生物大分子間作用力屬于分子間的弱相互作用，主要包括氫鍵作用力、范德華力、靜電作用力和疏水作用等非共價鍵。根據結合過程的熱力學參數(ΔH、ΔS和ΔG)大小和符號，可以判斷小分子與生物大分子間的主要作用力類型[18]。

(2)

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS,

(3)

Cor與DNA-EB體系反應的熱力學參數結果見表1。ΔH>0和ΔS>0表明Cor與DNA間非共價作用方式以疏水作用力為主，而ΔG<0和ΔH>0說明它們之間的相互過程為熵驅動的自發、吸熱過程。

3.3 共振散射光譜法研究Cor與DNA的作用

在利用共振散射光譜(RLS)研究Cor-DNA體系共振光譜特性之前，先對Cor和DNA的RLS特征進行表征。不同濃度Cor的RLS見圖3(a)。可以看出，Cor在372.1～400.0 nm范圍內都存在RLS譜帶，兩個尖銳的RLS峰位于450 nm和481 nm。RLS強度均隨Cor濃度的增加而逐漸變大，說明Cor濃度效應引起自聚集作用[19]。DNA溶液的RLS光譜見圖3(b)中的曲線6。可以看出，DNA在364.7 nm處有RLS峰，其強度低于Cor，曲線較平緩。當Cor與DNA反應形成結合產物后，其RLS見圖3(b)中曲線1～4。由圖可知，Cor-DNA體系RLS強度隨Cor濃度增加呈現出增大趨勢，同時體系的RLS形狀發生改變，在330 nm處出現了新的共振散射峰。當Cor濃度為4.0×10-6mol/L時，位于481 nm處的共振散射峰銳增。這是由于Cor以苯環結構嵌插到DNA堿基對后，由于Cor有不同程度的自聚集能力，可在DNA插入處表面完成自身聚集，成為超分子體系，使體系出現新的共振散射峰。另外，超分子體系的形成導致Cor-DNA體系體積變大，從而引起共振光散射增強。

(a) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L. (b) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L,cDNA=4.2×10-6mol/L; 5:cCor=1.0×10-6mol/L, 6:cDNA=4.2×10-6mol/L.

圖3 Cor(a)和Cor-DNA(b)體系的共振散射強度

Fig.3 RLS intensity in different complex concentration of Cor(a) and Cor-DNA(b) (T=310 K,λex=λem)

3.4 鹽效應實驗

DNA的磷酸基骨架帶有負電荷，很容易和帶正電荷的離子產生靜電作用。對于EB等嵌入到DNA內相鄰的堿基對之間的小分子而言，由于受到相鄰堿基對的保護，它對周圍環境的改變并不敏感[12]。若小分子以靜電作用模式與DNA結合，則增加的Na+勢必會競爭與DNA結合，導致DNA磷酸骨架周圍包裹Na+，進而阻止DNA與小分子的結合。不同濃度NaCl對DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光強度的影響結果見圖4。由圖可知，當Na+濃度為1.5×10-3mol/L時，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的F0/F分別為1.030和1.034。即Na+增加導致DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光強度微弱降低(0.30%和0.34%)，但趨勢相同。其原因在于，Na+等鹽類陽離子能以靜電方式與DNA的磷酸根作用，進而導致DNA磷酸骨架的靜電斥力減小，DNA鏈結構緊縮。相對于緊縮DNA結構而言，生理條件下DNA結構則更有利于堿基堆積的形成。因此，嵌入到DNA相鄰堿基對之間的EB和Cor，盡管受到上、下堿基對的保護對周圍環境中的Na+改變不敏感，但逐漸增加的Na+仍導致DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光猝滅。由此可知，Cor與DNA間的結合不是靜電結合或溝槽結合模式，而應該為嵌插結合。另外，當Na+濃度為1.0～1.5×10-3mol/L范圍內時，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的熒光強度趨于平衡。這是由于在該條件下，DNA磷酸根幾乎完全被Na+中和，其DNA結構緊縮程度具有相似性。而在Na+濃度相同條件下，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的熒光強度有所差別。這是由于EB三環平面基團和Cor苯環結構均以嵌入方式插入到DNA堿基對中，并形成有效堆積力，但其作用強度有所差別，Cor與DNA的堿基堆積力較EB略強。

圖4 NaCl對DNA-EB和Cor-DNA-EB熒光強度的影響

Fig.4 Effects of NaCl on the fluorescence intensity of DNA-EB and Cor-DNA-EB system

3.5 熔點實驗

小分子與DNA的相互作用能夠影響DNA熔點 (Tm)。其中，嵌入式結合能夠提高DNA雙螺旋的穩定性，使Tm增加5～8 ℃，而非嵌入式結合一般對DNA的Tm影響不大[20]。以溫度T為函數，繪制fss關于T的曲線(fss=ΔA′/ΔA=(A-A0)/(Af-A0))(A為表觀吸光度，A0為起始吸光度，Af為最終吸光度)。fss=0.5時，熔點曲線對應的溫度即為Tm。DNA和Cor-DNA熔解曲線見圖5。由圖可知，DNA的熔點為77 ℃，與Cor作用后DNA的Tm為82.5 ℃，即Tm增加了5.5 ℃。這再次表明，Cor與DNA發生了嵌插作用，該作用增加了DNA雙螺旋結構的穩定性。

cDNA=3.7×10-5 mol/L, cCor=9.0×10-5 mol/L

Fig.5 Thermal melting curves for DNA in the absence and presence of corilagin

4 結 論

采用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和共振散射光譜手段結合鹽效應和熔點實驗研究了Cor與小牛胸腺DNA的作用機制。在熵驅動下，Cor苯環結構能自發地嵌入到DNA堿基對中，堿基堆積是兩者間結合的非共價作用方式，其作用強度適中。另外，Cor在DNA嵌入處聚集形成超分子體系，該過程為吸熱反應。

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StudyonMechanismofInteractionsBetweenDNAandCorilaginbySpectroscopy

SHENBing-jun1,LIUZhan-wei2,LIURong-juan2,ZHANGJia-jia2,LINXiao-qian2,TIANJian1,JINLi-hong2*

(1.LaboratoryofCleanEnergyTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

Under the physiological condition of pH7.4, using ethidium bromide (EB) as the fluorescent probe, the interaction mechanism between coriolis (Cor) and calf thymus DNA was studied by UV-Vis absorption spectroscopy, resonance scattering spectroscopy combined with salt effect and DNA melting point. Cor can quench the fluorescence of EB-DNA system through a static process. The subtractive effect of the characteristic absorption peak occurrs after Cor interacts with DNA. The interaction leads to the enhancement of Cor resonance at481nm and a new resonance scattering peak at330nm. The salt effect has a little influence on the interaction between Cor and DNA. The interaction leads to the increase of theTmof DNA by5.5℃. It is deduced that the main way of the interaction between Cor and DNA is intercalation, and a supramolecular system is formed between them. The binding constant (KA) between Cor and DNA is5.82×103L/mol (298K) and2.47×104L/mol (310K). The interaction between Cor and DNA is entropy-driven spontaneous, endothermic. Hydrophobic forces are the main non-covalent mode of action.

corilagin; calf thymus DNA; spectra method; intercalation; reaction mechanism

2017-04-24；

2017-07-24

國家自然科學基金(21153003)； 吉林省教育廳項目(201574)； 長春理工大學博士后基金(2014年,889)資助項目

Supported by National Natural Science Foundation of China (21153003); Project of Jilin Provincial Department of Education (201574); Postdoctoral Fund of Changchun University of Science and Technology (2014,889)

1000-7032(2017)12-1681-07

O657.3

A

10.3788/fgxb20173812.1681

*CorrespondingAuthor,E-mail:jinlh@cust.edu.cn

申炳俊(1977-)，男，吉林通化人，博士，助理研究員，2017年于長春理工大學獲得博士學位，主要從事光譜分析理論與應用的研究。E-mail : bjshen@cust.edu.cn

金麗虹(1978-)，女，黑龍江富錦人，博士，副教授，碩士生導師，2011年于長春理工大學獲得博士學位，主要從事物質相互作用、生物檢測等的研究。E-mail : jinlh@cust.edu.cn