秸稈發酵飼料高產蛋白酵母菌株分離和篩選

陸敏 蘭宗寶 何立貴 趙武 姜源明 劉偉 孫建華 俸祥仁,4* 李顯 何莫斌

（1，廣西百朋種畜場 541502；2，廣西農科院農業科技信息研究所 530001；3，廣西獸醫研究所 530001；4，廣西南寧強微農牧科技有限公司 530001）

秸稈發酵飼料高產蛋白酵母菌株分離和篩選

陸敏1蘭宗寶2何立貴1趙武3姜源明3劉偉3孫建華3俸祥仁1,4*李顯1何莫斌1

（1，廣西百朋種畜場 541502；2，廣西農科院農業科技信息研究所 530001；3，廣西獸醫研究所 530001；4，廣西南寧強微農牧科技有限公司 530001）

為篩選出高產蛋白酵母菌株，推進秸稈發酵飼料在畜牧業中的應用。利用培養基平板劃線法從牛瘤胃食糜樣本中分離篩選出高產蛋白酵母菌株，通過正交試驗優化其培養條件，并依據生長曲線篩選出可作為秸稈發酵飼料用高產蛋白酵母菌。從牛瘤胃食糜樣本中共分離獲得10株菌落形態和細胞特征較明顯的疑似酵母菌株，分別編號為x1～x10。經正交試驗L16(44)優化其培養條件，發現在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產量最高。在10株分離酵母菌株中，生物產量最高的4株分別是x9號、x1號、x10號和x5號。其中，x9號和x1號菌株適的應期較短，在2h后即進入對數生長期，8h后達穩定期；x10號和x5號菌株的適應期較長，4h后進入對數生長期，1 h后進入穩定期。綜合酵母菌株的培養條件及生長曲線測定結果，確定假絲酵母屬菌株最適宜作為秸稈發酵飼料高產蛋白酵母菌。

青貯飼料；酵母菌；生物產量；分離；篩選；正交試驗

隨著畜牧業和生物技術的不斷發展，酵母類產品開發利用已成為飼料工業的新領域[1]。利用酵母菌發酵飼草飼料，具有成本低、原料廣、周期短、產量高等優點，可提高飼料營養物質的消化率和吸收率，減少飼料原料浪費，同時緩解蛋白質飼料資源日益短缺的矛盾，促進我國畜牧業結構轉型，推動畜牧業進一步發展[2,3]。青貯飼料中的微生物雖以乳酸菌為主，但酵母菌的種類和數量也不容忽視[4]。酵母菌利用青貯飼料中的糖分繁殖可增加青貯飼料的蛋白含量，同時生成乙醇等，使青貯飼料具有酒香味[5]。張秋華等[6]研究表明，采用酵母菌發酵雜粕（由豆粕、玉米臍子粕、菜籽粕和棉籽粕組成)生產菌體蛋白飼料的最佳培養基配方為接種量6%，料水比1.0∶1.4，氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)，溫度30℃，發酵周期24h，此條件下發酵終產物粗蛋白質含量57.76%，較發酵前提高48.33%。周廣麟等[7]研究確定了以纖維素酶和木聚糖酶與酵母菌協同發酵葡萄皮渣生產豬飼料的最佳配比為葡萄皮渣∶豆粕∶麩皮∶玉米面=2∶2∶1∶2；酶最適條件：纖維素酶3U/g，木聚糖酶5U/g，作用溫度50℃，時間72h。王雅波等[8]研究表明，采用畢赤酵母菌2.3250發酵的方法降解玉米皮中的纖維素類物質，能使其充分轉化為高附加值的飼料蛋白。因此，篩選出高產蛋白酵母菌株對大力發展秸稈發酵飼料具有重要意義。本研究利用培養基平板劃線法從富含酵母菌的牛瘤胃內容物中分離出酵母菌，并通過正交試驗對分離菌株進行培養條件優化，為推進秸稈發酵飼料在畜牧業中的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛瘤胃食糜樣本采自南寧市某屠宰場，采樣后裝入封口袋中密封，及時送回試驗室并置于4℃冰箱中保存。麥芽汁粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、瓊脂和純凈水等從市場購置，玉米秸稈粉從農戶處收購，烘干粉碎。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛瘤胃食糜中酵母菌增菌培養及分離純化

稱取新鮮牛瘤胃食糜樣品1.0g，均化后加入0.85%生理鹽水100ml，在180r/min、30℃的恒溫搖床中培養30min。然后用平板稀釋法在麥芽汁瓊脂培養基上接種增菌培養液，30℃培養3d，挑取單菌落進一步純化培養2～3次，將純化后得到的酵母菌單菌落編號接種于麥芽汁瓊脂斜面上，30℃恒溫培養 2～3d。

1.2.2 酵母菌生理生化鑒定

在麥芽汁粉培養基上接種純化酵母菌菌株，30℃恒溫培養48h后觀察菌落特征、細胞形態及子囊孢子、菌絲、擲孢子的形成情況，并進行葡萄糖發酵試驗、乙醇同化試驗、KNO3同化試驗和類淀粉化合物測定。

1.2.3 優化酵母菌培養條件

采用正交試驗L16(44)對酵母菌培養條件（溫度、初始pH、接菌量和裝液量)進行4個水平檢測（表1)，優化培養條件，并篩選出生長性能較好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸稈粉培養基，在不同條件下培養48h，測定其生物量。生物量測定：取1.0ml試驗生長菌液，用蒸餾水進行40倍稀釋，以接種前培養基同樣稀釋40倍為空白，分光光度計測定660nm處的OD。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 分離酵母菌的形態特征及生理生化鑒定結果

共分離出10株菌落形態和細胞特征較明顯的疑似酵母菌株，分別編號為x1～x10。在高倍顯微鏡下觀察菌落形態和細胞特征，然后根據 《常見細菌系統鑒定手冊》初步判定細菌屬。

由表2和表3可看出，x1號菌株呈乳白色，無醭膜，細胞形態為卵圓形，為多端芽殖，有菌絲生成，芽殖繁殖，無擲孢子，可發酵葡萄糖，KNO3同化試驗呈陽性，類淀粉物質生成和乙醇同化試驗均為陰性，故初步判定為酒香酵母屬。

x2號菌株呈乳白色，細胞形態為卵圓形，僅一端芽殖，有菌絲形成，芽殖繁殖，葡萄糖發酵試驗、類淀粉物質生成試驗和KNO3同化試驗均呈陰性，乙醇同化試驗呈陽性，故初步判定為瓶形酵母屬。

x3號和x5號菌株的顏色均為白色，細胞形態呈圓形，多端芽殖，無菌絲生成，芽殖繁殖，葡萄糖發酵試驗、類淀粉物質生成試驗和乙醇同化試驗均呈陰性，根據 《常見細菌系統鑒定手冊》可初步判定這兩株菌株為卵孢酵母屬。

x4號菌株呈乳白色，細胞形態圓形，兩端芽殖，有菌絲生成，芽殖繁殖，有子囊內含有1～2個帽形孢子，類淀粉物質生成試驗、KNO3同化試驗和乙醇同化試驗均呈陽性，葡萄糖發酵試驗呈陰性，故初步判定為裂芽酵母屬。

x6號菌株呈乳白色，細胞形態卵圓形，多端芽殖，無菌絲生成，芽殖繁殖，有擲孢子生成并伴有鎖狀聯合，葡萄糖發酵試驗和KNO3同化試驗呈陽性，類淀粉物質生成試驗和乙醇同化試驗呈陰性，故初步判定為鎖合擲孢酵母屬。

x7～x10號菌株顏色呈白色或乳白色，細胞形態圓形，有假菌絲，且可形成真菌絲，芽殖繁殖，無有性繁殖，類淀粉物質生成試驗呈陰性，根據 《常見細菌系統鑒定手冊》初步判定x7～x10號菌株為假絲酵母屬。

2.2 培養條件優化篩選結果

正交試驗L16(44)結果表明，x1～x10號菌株的最佳培養組合均為A2B1C4D3(表4)，即在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產量最高。在10株分離酵母菌株中，生物產量最高的4株分別是x9號（OD660nm=1.6220)、 x1號（OD660nm=1.5765)、 x10號(OD660nm=1.5738)和x5號（OD660nm=1.5709)。

2.3 生長曲線測定結果

將優化培養篩選出的4株分離酵母菌菌株按照其最佳培養條件搖床（180r/min)培養48h，測定各菌株的生長曲線。由附圖可知，x9號和x1號菌株適的應期較短，在2h后進入對數生長期，生長速度較快，8h后達穩定期；x10號和x5號菌株的適應期較長，4h后進入對數生長期，12h后進入穩定期。

3 討論

酵母菌是單細胞真菌，具有典型的真核細胞結構，在自然界廣泛存在。酵母細胞中蛋白質占細胞干重的32～75%，糖類物質占細胞干重的27～63%。酵母細胞中還富含維生素、多種消化酶和未知的生長因子，因此在食品、醫療保健、飼料、釀酒、生物工程等行業中得到廣泛應用[5]。經發酵菌發酵過的飼料，含有更多的活性益生菌菌體、各種酶、各級代謝產物、多種維生素、活性小肽、氨基酸、抑菌物質等，既改善動物飼料的品質和適口性，消化吸收率明顯提高，還具有維持動物腸道菌群平衡、促進動物生長、提高動物免疫力等作用[3,9,10]。但目前市場上可用于飼料發酵的酵母菌產品較少，且不同酵母菌的培養條件也不同。

表2 分離酵母菌的菌落形態和細胞形態特征

表3 分離酵母菌的生理生化鑒定結果

表4 分離酵母菌的正交試驗結果

附圖4 株酵母菌分離株的生長曲線

本研究利用培養基平板劃線法從牛瘤胃食糜樣本中分離獲得10株菌落形態和細胞特征較明顯的疑似酵母菌株，經正交試驗L16(44)優化其培養條件，發現在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產量最高，與鄧露芳等[1]的研究結果基本一致。在10株分離酵母菌株中，生物產量最高的4株分別是x9號、x1號、x10號和x5號。其中，x9號和x1號菌株適的應期較短，在2h后即進入對數生長期，8h后達穩定期；x10號和x5號菌株的適應期較長，4h后進入對數生長期，12h后進入穩定期。綜合酵母菌株的培養條件及生長曲線測定結果，確定假絲酵母屬菌株最適宜作為青貯用高產蛋白酵母菌。

4 結論

綜合酵母菌株的培養條件及生長曲線測定結果，確定x9號菌株最適宜作為秸稈發酵飼料高產蛋白酵母菌。

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廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科轉14125006-16)；廣西創新計劃專項經費項目（2015CXJHB019)；廣西水產畜牧科技推廣應用項目（桂漁牧科201528001，桂漁牧科201633033)；柳江縣科學研究與技術開發計劃項目（201606)。

陸敏（1977-），男，壯族，廣西柳江縣人，大專，助理畜牧師，主要從事畜牧獸醫新技術的研究與推廣。

*通訊作者，俸祥仁（1978-)，高級獸醫師，主要從事畜牧獸醫研究工作。