青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關因子及炎癥介質表達的影響

袁紅剛

（漢川市人民醫院神經外科，湖北 漢川 431600）

青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關因子及炎癥介質表達的影響

袁紅剛

（漢川市人民醫院神經外科，湖北 漢川 431600）

目的 探討青蒿素對大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質表達的影響。方法 采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，健康SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、青蒿素預處理組。缺血2 h，再灌注24 h后，處死大鼠，腦組織取材。采用實時熒光定量PCR檢測Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA水平。采用ELISA法檢測TNF-α和IL-1β蛋白水平。結果 與假手術比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達水平上調(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值下調(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高(P＜0.05)，青蒿素預處理可明顯下調Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平(P＜0.05)，上調Bcl-2/Bax比值(P＜0.05)。結論 青蒿素對腦缺血再灌注損傷后的腦組織具有保護作用。

青蒿素；Bcl-2；Bax；腫瘤壞死因子α；腦缺血再灌注損傷

缺血性腦血管病嚴重危害人類健康。近年來，腦缺血再灌注后細胞凋亡一直是研究的熱點，然而其發生機制目前尚不明確。目前已經確認的是，細胞凋亡不僅受凋亡相關因子的調控，還被許多內外因素所調節，包括氧化應激、炎癥反應等。因此有效地減少腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡[1-3]，可以減輕缺血再灌注對腦組織的損傷，有助于神經功能的恢復。青蒿素是一種菊科植物黃花蒿中提取物，是世界衛生組織公認的抗瘧疾藥物。大量的研究證實，青蒿素還具有多重生物學效應，如免疫調節、抗炎癥、抗凋亡及抗纖維化等。本研究通過線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察青蒿素預處理對腦缺血再灌注損傷后Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平的影響，探討青蒿素腦保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組 SPF級健康Sprague-Dawley雄大鼠80只，8周齡，體質量250～300 g。由武漢大學實驗動物中心提供。隨機分成3組，即假手術組（n=20）、模型對照組（n=30）、青蒿素組（n=30）。

1.2 模型制作 參照Zea線栓法（Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats），3%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為40～50 mg/kg。將大鼠固定于鼠板上，頸部正中切口，分離右側頸總動脈，順著右側頸總動脈經頸內動脈插入制備好的線栓，直到遇到阻力為止，阻斷大腦中動脈血流2 h,拔出線栓，形成再灌注。假手術除了不插入線栓，其他步驟與另外兩組一致。再灌注24 h處死大鼠，腦組織取材。

1.3 給藥途徑 青蒿素組在造模1周前給予青蒿素灌胃，劑量為5 mg/（kg·d）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測大鼠腦組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA表達 取大鼠腦組織 Trizol法，嚴格按照說明書提取總mRNA。Fas：上游引物5′-GTG ATG AAG GGC ATG GTT TAG-3′，下游引物5-′GCA TTT GGT GTT GCT GGT T-3′；FasL：上游引物5′-ACC ACC TCC ATC ACC ACT ACC-3′，下游引物5′-CAT TCC AAC CAG AGC CAC C-3′；Bcl-2：上游引物5′-TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT-3′′，下游引物5′-CTG ATT TGA CCA TTT GCC TG-3′；Bax：上游引物5′-TGA ACT GGA CAA CAA CAT GGA G-3′，下游引物 5′-AGC AAA GTA GAA AAG GGC AAC C-3′；β-actin：上游引物5′-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3′，下游引物5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′。

1.5 腦組織TNF-α和IL-1β水平檢測 腦損傷后24 h小時分別斷頭處死6只，在冰上分離右頂傷灶附近腦組織，置于冷生理鹽水中漂洗稱重，然后研磨勻漿，以3 500 r/min、-4℃離心10 min,提取上清液后按照ELISA試劑盒進行操作。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料采用“x±s”表示，各組樣本均數采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Fas和FasL mRNA表達 與假手術組比較，模型組Fas和FasL mRNA表達水平顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Fas和FasL mRNA表達顯著下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Fas和FasL mRNA水平Figure1 Fas and FasL mRNAlevels

2.2 Bcl-2和Bax mRNA表達 與假手術比較，模型組Bcl-2和Bax mRNA水平顯著上調，Bcl-2/Bax比值顯著下調，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Bcl-2 mRNA水平和Bcl-2/Bax比值顯著上調，Bax mRNA水平顯著下調，且差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 A.Bd-2和Bax mRHA水平；B.Bcl-2/Bax比值Figure 2 A.bd-2 and Bax mRHAlevel;B.Bcl-2/Bax ratio

2.3 TNF-α和IL-1β水平與假手術比 模型組TNF-α和IL-1β水平均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組TNF-α和IL-1β水平均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組TNF-α和IL-1β水平比較（x±s）Table 1 Comparison of TNF-alpha and il-1 beta levels in 3 groups(x±s)

3 討論

本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的基礎上，給予青蒿素對其進行干預，結果顯示，與假手術比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達水平上調，Bcl-2/Bax比值下調，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高，青蒿素干預可明顯下調Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平，上調Bcl-2/Bax比值，提示青蒿素可通過抑制神經細胞凋亡及炎癥反應來發揮神經保護作用[4-6]。

細胞凋亡是受基因調控的主動性死亡。大量的研究表明，細胞凋亡參與缺血引起的神經細胞死亡。腦組織缺血時，缺血中心細胞快速的發生壞死，半影區則主要以凋亡的機制發生遲緩性細胞死亡[7-10]。Fas屬于腫瘤壞死因子的受體家族成員，是一種具有重要功能的細胞表面受體，其與FasL相互作用可介導缺氧所致的細胞凋亡。Fas是參與腦缺血后神經細胞凋亡的重要因素之一，另外，Fas/FasL通路的激活還介導Caspase-3的激活。本研究結果顯示，青蒿素預處理可以降低腦缺血再灌注損傷后的Fas和FasL mRNA表達水平。Bcl-2是抑制細胞凋亡的關鍵基因，其還可以調節Ca2+流入細胞，抑制氧自由基的產生。Bax是細胞凋亡的促進基因[11-12]，并對抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用。Bcl-2與Bax表達的比值決定著細胞在受到凋亡刺激信號后的存亡。在腦缺血再灌注后，Bcl-2/Bax比值降低時促進細胞凋亡，比值升高時促進細胞存活。本研究中，青蒿素干預腦缺血再灌注損傷可上調Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值，同時下調Bax mRNA表達，抑制細胞凋亡，從而保護了腦組織。

本研究還發現給予青蒿素預處理可減少腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白水平。腦缺血激發的炎癥級聯反應在缺血再灌注損傷中發揮著中要用。目前已經證實，短暫性腦缺血就會誘導TNF-α和IL-1β等促炎癥因子的表達。TNF-α是體內最主要的炎癥因子，TNF-α過度表達可直接作用的血管內皮細胞，改變其通透性，還刺激內皮細胞合成并釋放IL-1β。TNF-α過度表達還可誘導細胞凋亡。TNF-α引發一系列炎癥介質的始發因素，對腦缺血后腦組織具有損害作用。IL-1β是一種多功能的細胞因子，在正常腦組織中只有少量表達，其在正常中樞神經系統發育和腦對各種損傷的反應中發揮重要作用。IL-1β不僅可以促進T、B細胞活化，還可以誘導TNF-α、IL-6等炎癥因子的產生。IL-1β參與腦水中形成及神經元壞死。我們有理由相信本研究結果表明的青蒿素預處理能降低腦缺血再灌注損傷后炎癥介質TNF-α、IL-6的表達，能減少其過度釋放導致的腦細胞繼發性損傷，有助于神經功能的恢復。

綜上所述，本研究觀察青蒿素能降低腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質的表達，證明青蒿素具有腦細胞保護作用，從分子水平對其作用機制研究的一種擴充，但具體機制仍有待于進一步研究，為臨床開展腦保護治療提供新思路。

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Effects of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators

Yuan Hong-gang
(Neurosurgery of hanchuan people's hospital,Hanchuan,Hubei,431600,China)

Objective To observe of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators.Methods 80 male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups：sham group,model group and artemisinin group.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method(ischemia for 2 hour and reperfusion for 24 h).After that were sacrificed by decapitation,the mRNA level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax were measured by real time RT-PCR,the level of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA.Results The level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax,TNF-α and IL-1β were increased significantly in rats with focal cerebral ischmeia-reperfusion(P＜0.05).Compared with the model group,The level of Fas,FasL,Bax,TNF-α and IL-1β were decreased significantly in rats of artemisinin group(P＜0.05),the Bcl-2 was up regulated(P＜0.05).Conclusion Artemisinin exert a protective effect against focal cerebral ischmeia-reperfusion via reducing apoptosis and inflammation.

Artemisinin;Bcl-2;Bax;TNF-α;Cerebral ischmeia-reperfusion

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.33.010