以自然之力恢復自然
——湘潭縣鳳形山有益微生物篩選鑒定研究

文湖南師大附中梅溪湖中學 李潤龍中南大學第一附屬中學 王子璇 何凱科

以自然之力恢復自然
——湘潭縣鳳形山有益微生物篩選鑒定研究

文湖南師大附中梅溪湖中學 李潤龍中南大學第一附屬中學 王子璇 何凱科

2016年暑假，我們去湘潭縣鳳形山學習考察時得知，長沙某大酒店高管左叔叔一直想憑借自己的努力，在鳳形山建設有機農場，帶動鄉親們致富。他決心告別目前“大農藥、大化肥”等技術為主的化學農業模式，轉向“動物、植物與微生物完美配合、自動循環”的有機生態農業模式，以保證農產品品質、保護消費者健康，達到“以自然之力恢復自然”“天人合一”的理想境界。

鳳形山區域零星分布著一些長勢良好的一季稻，主要供村民自己食用，幾乎沒有施用農藥、化肥及除草劑等。

村里長壽老人多，夏天蚊蟲少，水稻生長茂盛，很少發生病蟲害。而周邊幾個村子的水稻或多或少都發生過紋枯病之類的病害，造成嚴重的減產甚至絕收。

我們猜想，鳳形山可能具有獨特的微生態環境，其中某些有益微生物抑制了水稻病害的發生。因此，有必要篩選經濟高效、無副作用的有益微生物，將其應用于有機水稻等農產品病害防治的研究，并探索有益微生物協同防治水稻紋枯病的新途徑。

一、擬建生態農場區域環境檢測

參考關于有機農場開發與環境相適應的評價方法的相關文獻，鳳形山區域環境中大氣污染物、土壤和水源的重金屬及農殘等技術指標均達到有機農場的建設要求。

在無人工干預之下，該區域良好的自然環境及微生態系統經過三十多年的自由生長，很可能孕育了一系列有益微生物種群，通過篩選、分離和鑒定，為有機水稻等農產品病害防治和有機農場的建設創造條件。

二、土壤微生物取樣及培養

1.土壤微生物取樣

采樣地點為湘潭縣中路鋪鎮鳳形山。通過手機定位在擬建有機農場定位三地塊15個點，每個點分四層取樣，培養和篩選優勢菌株。

2.樣品分類

樣品分為四類：表層土壤；1cm~10cm土層土壤；10cm~20cm土層土壤；20cm~30cm土層土壤。

表層土壤

1cm~10cm

10cm~20cm

20cm~30cm

3.土壤微生物培養

a.取一定量陰干的土壤，置于滅菌后的研缽內研磨，使土壤顆粒均勻、細膩。稱取1g研磨好的土樣，加入9mL無菌水用力振蕩15min，使土樣分布均勻，成為土壤懸液。

b.取1mL土壤懸液滴入滅菌試管中，用無菌水依次稀釋成3個濃度梯度，分別為 10、100、1 000。分別取土壤稀釋液1 000倍液100uL，用滅菌的L型玻璃棒均勻地涂于LB培養基和PDA培養基平板上，于28℃恒溫培養48h。

c.挑選各個菌落分離培養。挑取真菌菌落置于PDA平板培養，挑取細菌菌落在LB平板進行劃線培養。

結果表明，鳳形山荒廢多年的平緩坡地土壤中的微生物種類豐富，且菌落種數表層土壤＞1cm~10cm土層＞10cm~20cm土層＞20cm~30cm土層，底層微生物以厭氧真菌為主，好氧細菌很少。

三、微生物菌落分離

通過觀察在LB平板和PDA平板上生長的菌落的形態、顏色、生長狀況等，共挑選出6種細菌和2種真菌。

其中細菌分別標號為ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-5、ZN-6，真 菌標號 為ZN-A、ZN-B。

隨后挑選了5株細菌（ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6）和 2 株真菌進行菌種鑒定。

四、微生物菌種鑒定

樣品采用 Bacterial DNA Kit（Omega）試劑盒進行基因組DNA提取，再經過Sanger測序、建庫上機測序，得到的原始序列在Galaxy平臺進行質控后獲得初處理序列。將獲得的初處理序列中含有重疊部分的序列進行拼接，然后將重復序列去除。

將拼接后的序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行核苷酸 blast比對，比對結果利用RDP獲取物種分類信息。

五、微生物基因序列及分析鑒定

NCBI的比對結果顯示，ZN-2基因序列有946個堿基，與芽孢桿菌屬的多個種的細菌完全匹配，E-value為0，且覆蓋率高達99%，可以確定ZN-2屬于芽孢桿菌屬。

選擇其中相似性較高的分布在芽孢桿菌屬的15種細菌，下載它們的基因序列，使用軟件MEGA 5.0繪制系統發育樹，發育樹顯示ZN-2與Bacillus pumilus strain NJ-M2的親緣關系最接近，所以推猜測ZN-2屬于短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。

ZN-2短小芽孢桿菌

5株微生物中ZN-1為假單胞菌屬，ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6 分別為短小芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、甲基營養型芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿；ZN-A、ZN-B及ZN-5有待進一步鑒定。

由此可以初步斷定，鳳形山獨特的有益微生物極有可能是芽孢桿菌菌落。芽孢桿菌屬的絕大多數菌種都有很好的安全性，不會對環境造成再次污染。這些有益芽孢桿菌的發現為有機農場的建設及有機水稻的生產奠定了良好的基礎。（指導老師：段家鐵 蔣銀生）