S100B基因rs881827多態性與缺血性腦卒中的遺傳易感性研究

陸玉蘭 黃華佗 王榮 劉純宏 藍艷 韋葉生

【摘要】目的探討星形膠質源性蛋白（S100B）基因單核苷酸多態性（SNP）rs881827與缺血性腦卒中（IS）的相關性。

方法采用單堿基延伸的PCR技術（SBEPCR）和DNA測序法對396例IS患者（病例組）及398例體檢者（對照組）的S100B基因rs881827位點進行基因分型；用非條件Logistic回歸計算比值比（OR）、95%置信區間（95%CI）、顯性模型（TT/CT vs.CC）、隱性模型（CT/CC vs.TT）和超顯性模型（CC/TT vs.CT），從而分析rs881827多態性與IS的發病風險。

結果兩組間基因型和不同遺傳模型比較結果顯示，rs881827位點SNP可能與IS的遺傳易感性無關（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22； TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC： OR=0.75，95%CI 053～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～1.26，P=0.53）。

結論S100B基因rs881827位點SNP可能與IS的遺傳易感性無關。

【關鍵詞】S100B；缺血性腦卒中；單核苷酸多態性；易感性

中圖分類號：R743.3；R394 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.05.001

Study on polymorphisms of rs881827 in S100B gene and geneticsusceptibility to ischemic stroke

[HJ2][HJ]

LU Yulan1，HUANG Huatuo1，WANG Rong1，LIU Chunhong3，LAN Yan2，WEI Yesheng3▲

（1.Graduate School，2.Department of Dermatology of Affiliated Hospital，3.Department of Laboratory Medicine of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between single nucleotide polymorphism（SNP）rs881827 in S100B gene and susceptibility to ischemic stroke（IS）.

MethodsSNP rs881827 genotyping in S100B gene was performed by polymerase chain reactionsingle base extension PCR（SBEPCR）and DNA sequencing among 396 cases of IS patients（case group）and 398 physical examinees（control group）.Odds ratio（OR），95% confidence intervals（95%CI），dominant model（TT/CT vs.CC），recessive model（CT/CC vs.TT）and over dominant model（CC/TT vs.CT）were measured by unconditional Logistic regression analysis to analyze the risk of rs881827 polymorphism and IS.

ResultsComparison of genotypes and different genetic models between the two groups showed that SNP in rs881827 locus may be unrelated to the genetic susceptibility of IS（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs. CT：OR=090，95%CI 0. 64～1.26，P=0.53）.

ConclusionS100B gene rs881827 polymorphism may be not associated with susceptibility to IS.

【Key words】S100B；IS；SNP；susceptibility

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是由多因素共同參與而導致的一類復雜疾病，具有高發病率、高致殘率、高復發率和高死亡率的特點，給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔[1]。近年來，我國IS的發病率逐年上升，而且發病人群呈年輕化趨勢[2]。流行病學研究表明年齡、性別、肥胖、高血壓、糖尿病、吸煙和血脂異常等傳統因素與IS的發病密切相關[3]。然而，IS的確切病因及發病機制至今尚未完全闡明。越來越多的家族性病例報道說明IS有明顯的遺傳傾向[4]。星形膠質源性蛋白（S100B）是一種主要由星形膠質細胞分泌的酸性鈣結合蛋白，為S100超家族中的成員之一。S100B可通過與晚期糖基化終末產物受體（RAGE）結合后激活蛋白激酶/cJun氨基末端激酶（JNK）通路及P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，從而導致細胞應激和細胞凋亡[5～6]。此外，S100B與RAGE結合可誘導IL1、IL6、IFNγ、TNFα等細胞因子表達上調，從而參與機體免疫調控和炎癥反應[7]。既往研究表明，S100B蛋白可作為輔助診斷缺血性腦卒中、顱腦損傷和腫瘤腦轉移的有效指標[8～10]。隨著分子生物學技術的不斷發展，人們發現編碼S100B基因存在單核苷酸多態性（SNP）位點，而這些SNP位點與自閉癥、精神分裂癥等多種疾病密切相關[11～12]。然而，S100B基因多態性與IS發病是否相關尚未見報道。因此，在本研究中，我們通過病例對照研究的方法，探討S100B基因多態性與IS的發病風險，為從分子水平上揭示IS的發病機制提供依據，也為盡快發現IS的危險人群、預防IS的發生提供重要的參考信息。endprint

1資料與方法

1.1研究對象

對照組：隨機選取同一時期到右江民族醫學院附屬醫院體檢中心進行體檢的體檢者398例，其中男性231例，女性167例，平均年齡（58.09±8.76）歲，所有研究對象均來自廣西地區，且相互無血緣關系。排除自身免疫性疾病、腫瘤、心腦血管疾病及感染性疾病等。本研究獲得右江民族醫學院附屬醫院醫學倫理委員會的批準。所有受試對象均已簽署知情同意書。IS組：選取2013年1月～2016年9月入住右江民族醫學院附屬醫院神經內科，與對照組性別、年齡相匹配的IS患者396例，其中男性252例，女性144例，平均年齡（59.16±9.18）歲。IS的診斷均符合第四屆全國腦血管病學術會議的診斷標準。全部IS患者均經頭顱CT或MRI掃描確診，不包括心源性、動脈炎、外傷、腫瘤、腦血管畸形等引起的腦卒中。

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取采集體檢者靜脈血3 ml，用含有EDTAK2抗凝劑的采血管保存；采用試劑盒離心柱法（TIANamp Blood DNA Kit）進行基因組DNA提取，-70℃保存備用。

1.2.2引物設計與合成從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲取S100B基因SNP序列，用在線Primer3 軟件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）輔助設計PCR引物，并由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增的S100B基因rs881827引物序列詳見表1。

1.2.3PCR擴增采用20 μL反應體系，其中包括1× GCⅠ緩沖液（Takara.）、1 μL多重PCR引物、1 U HotStarTaq聚合酶（Qiagen Inc.）、3.0 mM鎂離子、0.3 mM dNTP、1 μL DNA模板，余下體積用經過嚴格高壓滅菌的雙蒸水補足。PCR反應參數：95℃預變性 2 min；擴增階段：94℃預變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，循環11次；94℃預變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環24次；最后階段72℃延長2 min。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經過蝦堿酶（SAP：from Promega） 和外切酶I（EXO I：from Epicentre）純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用蝦堿酶（SAP：from Promega）純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）來分析（由上海天昊科技有限公司承做）。

1.3臨床基本資料收集

利用醫院的病例管理系統收集已確診為IS患者的臨床基本資料，主要包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和極低密度脂蛋白膽固醇（VLDLC）等。吸煙定義為吸煙≥1支，且一生中連續或累積吸煙≥6個月。

1.4統計學方法

用SPSS 17.0軟件包對實驗數據進行分析。采用HardyWeinberg遺傳平衡定律評估樣本的群體代表性；計量資料用（±s）表示，采用t檢驗。分類變量采用χ2檢驗；經相關混雜因素（性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、TCH、TG、HDLC、LDLC和VLDLC）調整，采用非條件Logistic回歸方法計算對照組與IS組的顯性模型（TT/CT vs.CC）、隱性模型（CT/CC vs.TT）和超顯性模型（CC/TT vs.CT）的比值比（OR）、95%置信區（CI）。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果

2.1S100B基因rs881827基因型測序結果經檢驗S100B 基因rs881827位點基因型分布符合HardyWeinberg平衡（P值為0.902），表明本研究具有群體代表性。測序結果顯示，rs881827位點包含TT、CT、CC三種基因型，DNA測序證實了我們的結果。見圖 1。

2.2IS組和對照組的基本臨床資料IS患者和對照者的性別、年齡和TCH分布差異無統計學意義（P>0.05），而高血壓、糖尿病、吸煙、TG、HDLC、LDLC、VLDLC在兩者間比較差異有統計學意義（P<0.05或0.01）。見表2。

2.3S100B基因多態性rs881827 SNP與IS易感性的關聯分析分析比較對照組和IS組S100B基因rs881827位點的基因型頻率和等位基因頻率，結果顯示，IS患者的CC基因型（37.2%）、CT基因型（492%）、C等位基因（61.7%）高于對照組的CC基因型（34.4%）、CT基因型（48.2%）、C等位基因（585%），但兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。同時，我們采用非條件Logistic回歸方法分析兩組間基因型和不同遺傳模型的比較，結果表明，S100B基因rs881827位點SNP可能與IS的遺傳易感性無關（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～115，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～109，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～107，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 046～119，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～126，P=0.53）。見表3。

2.4S100B基因rs881827多態性與不同人群的比較經分析，廣西人群S100B基因rs881827位點基因型和等位基因頻率分布與國際人類基因組單體型圖計劃數據庫（Hap Map）的Hap MapCEU、Hap MapYRI、Hap MapJPT、Hap MapHCB、Hap MapASW、Hap MapGIH、Hap MapLWK、Hap MapMEX人群相比差異有統計學意義（P<0.05）；與Hap MapCHB相比，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。endprint

3討論

IS是由各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙，導致腦組織缺血、缺氧而發生的軟化壞死，進而產生臨床上對應的神經功能缺失表現，嚴重影響患者的生存質量。目前認為IS是一種由環境因素與遺傳因素共同作用誘發的復雜疾病。

S100B基因定位人類染色體21q22.3區域，包含3個外顯子和2個內含子，mRNA長度為1095bp，編碼91個氨基酸。其啟動子區包括數個潛在的調控轉錄成分，如CAMP反應元件CRE和AP2、SP1結合位點GC框。S100B主要由星形膠質細胞和施萬細胞表達，是S100蛋白超家族中具有活性的成員，約96%存在于腦內，因此被稱為腦特異性蛋白。高濃度的S100B可通過與晚期糖基化終末產物受體（RAGE）結合后激活多種信號通路，從而誘導IL1、IL6、IFNγ和TNFα等多種細胞因子的釋放，而這些細胞因子被發現在IS的發病中均起著重要的作用[13～14]。此外，高濃度的S100B可發揮神經毒性作用，通過一氧化氮依賴途徑誘導神經元細胞凋亡[15]。同時，越來越多的研究表明，S100B蛋白表達水平在IS的發生、發展中發揮重要的作用，Selcuk等[16]檢測50例IS患者的S100B血清水平發現，與對照組比較，IS組S100B血清水平顯著升高，且S100B濃度隨腦梗死體積的增大而增加。Mori等[17]研究發現大腦中動脈閉塞的小鼠中，超表達S100B組梗死面積和神經功能損傷程度較對照組明顯嚴重，認為大腦中動脈閉塞后超表達的S100B可加速腦損傷及增大梗死面積。然而，S100B蛋白在IS中的表達機制目前仍未明確。

近年來已有一些文獻報道S100B基因多態性與疾病遺傳易感性關系的研究[11～12，18]。然而S100B基因rs881827 SNP是否與IS遺傳易感性相關，目前尚未見文獻報道。在本次研究中我們發現，S100B基因rs881827位點SNP可能與IS的遺傳易感性無關。產生此結果的可能原因有：首先，IS是一種復雜性疾病，可能是由很多基因參與其發病過程，一個單獨基因在其發病原因中起的作用很小，而更多的是基因與基因之間的交互作用的結果。其次，本研究所選取的樣本量較小以及樣本選擇的偏倚也可能是造成此陰性結果的原因之一。最后，既往研究結果表明，同一個位點SNP在不同人群、不同疾病中所發揮的作用并不一致，因此，S100B基因rs881827 SNP可能與廣西人群IS的遺傳易感性無關，但是其可能與其他人群的IS發病具有相關性，這是我們后續的研究方向。此外，值得注意的是，基因多態性有不同種族和不同地區人群間的差別，正如表4所示，我們發現，廣西人群rs881827位點基因型在不同種族間甚至在同一種族不同人群間的分布也表現出不同程度的差異。因此，擁有不同遺傳背景的人群對疾病的遺傳易感性也有可能不同。

綜上所述，雖然我們通過多方面系統地分析發現，S100B基因rs881827位點SNP可能與IS的遺傳易感性無關。但是，基因多態性有不同種族和地區人群間的差別，因此，該結果仍需要經大樣本、多地域、多民族的廣泛深入研究，以期為IS的風險預測、治療以及評估預后提供一條新的線索和途徑。

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（收稿日期：2017-06-09修回日期：2017-07-04）

（編輯：潘明志）endprint