HPLC法同時(shí)測定綠咖啡豆中綠原酸及咖啡堿含量

王光路，李長文，，劉志達(dá)，劉順航，徐詠全，*

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津300410；2.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南普洱665000）

HPLC法同時(shí)測定綠咖啡豆中綠原酸及咖啡堿含量

王光路1，李長文1，2，劉志達(dá)2，劉順航2，徐詠全1，*

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津300410；2.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南普洱665000）

建立一種高效液相色譜法（HPLC），可同時(shí)定量綠咖啡豆中綠原酸和咖啡堿的含量，并分析不同成熟度綠咖啡豆中綠原酸和咖啡堿含量變化。采用Agilent ZORBAX ODS-C18色譜柱，以0.5%乙酸水-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測波長274 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35℃。結(jié)果顯示，綠原酸和咖啡堿的濃度線性范圍分別為5.0 mg/L～100.0 mg/L（r2=0.999 9）和 5.1 mg/L～101.6 mg/L（r2=0.999 9），檢出限分別為 0.25 mg/L 和 0.05 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.56%和1.30%，回收率范圍分別為98.86%～101.11%（RSD=1.02%）和98.70%～101.19%（RSD=0.83%）。

綠咖啡豆；綠原酸；咖啡堿；高效液相色譜法（HPLC）；含量

綠咖啡豆是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）小粒咖啡（Coffea arabica）、中粒咖啡（Coffea robusta）及大粒咖啡（Coffea liberica）的種子[1]，含有豐富的活性物質(zhì)，其中綠原酸類物質(zhì)可以占到咖啡豆干重的4%～14.4%[2-3]，而咖啡堿約占1%～2%[4]。綠咖啡豆中綠原酸共有9種同分異構(gòu)體[5]，其中以5-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）為最多，約達(dá)到總含量的56%～62%[6]。綠原酸的多種藥理作用如抗氧化[7]、抗病毒[8]、抗癌[9]、抗腫瘤[10]、降糖[11]及消脂[12]等，已被科學(xué)界所證實(shí)。而咖啡堿，在醫(yī)藥上可作麻醉劑、興奮劑、利尿劑和強(qiáng)心劑[13]，但大劑量或長期使用可引起陣發(fā)性驚厥，損害肝、胃、腎等重要內(nèi)臟器官。因此，綠原酸及咖啡堿的含量檢測是綠咖啡豆產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

目前，有多篇文獻(xiàn)[14-16]研究了咖啡豆中綠原酸或咖啡堿單一成分的檢測，但是針對綠咖啡豆中綠原酸和咖啡堿的同時(shí)檢測鮮有報(bào)道。Fujioka報(bào)道了一種同時(shí)檢測咖啡中綠原酸和咖啡堿的方法[17]，但需采用多波長檢測器；楊青山等[18]建立了一種咖啡豆中綠原酸和咖啡堿的超高效液相色譜測定方法，雖然該方法簡單、快速，但是對檢測設(shè)備要求高，對于中小型企業(yè)，并不適合推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)在楊青山等[18]研究基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)測定綠咖啡豆中綠原酸和咖啡堿的高效液相色譜法，本法操作簡便、快速，檢測設(shè)備要求低，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于綠咖啡豆的質(zhì)量控制。此外，使用上述方法，本研究還分析了綠咖啡豆在不同成熟期的綠原酸和咖啡堿含量變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；AB135-S電子分析天平：梅特勒公司；Mill-Q超純水凈化系統(tǒng)：美國Millipore公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FW100萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；DGG-101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

咖啡鮮果（小粒咖啡）：云南省普洱市農(nóng)戶采收；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度96.2%）：中國食品藥品檢定研究院；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：天津馬克生物技術(shù)有限公司；冰醋酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同成熟度綠咖啡豆預(yù)處理

綠咖啡豆采收于固定的3株咖啡樹，采收后混勻，迅速冷藏并郵寄至天津，采收時(shí)間為每月二十號。

綠咖啡豆預(yù)處理：1）將不同成熟度綠咖啡豆進(jìn)行烘干，30℃鼓風(fēng)干燥8 h；2）手工將綠咖啡豆外果皮（含果肉）和內(nèi)果（含膠質(zhì)層、內(nèi)果皮以及胚乳等）進(jìn)行剝離；3）將分開的外果皮和內(nèi)果，分別再次烘干，40℃鼓風(fēng)干燥6 h；4）將內(nèi)果部分去除內(nèi)果皮（羊皮紙層），即得綠咖啡豆，備用；

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別精密稱取綠原酸和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg和10.16 mg，用70%甲醇溶解于100 mL容量瓶，室溫下超聲處理10 min，定容搖勻作為儲(chǔ)備液，濃度分別為100.0 mg/L和101.6 mg/L；使用70%甲醇分別稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，作為梯度標(biāo)準(zhǔn)工作液，過 0.45 μm濾膜備用。

1.2.3 供試品溶液制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道方法，將1.2.1中咖啡豆粉碎至40目通過率80%以上細(xì)度，將篩上物和篩下物混合均勻后，作為待測樣；參考文獻(xiàn)[18]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22250-2008《保健食品中綠原酸含量測定》中方法進(jìn)行超聲提取，即準(zhǔn)確稱取0.500 g待測樣，置于50 mL容量瓶中，加入45 mL 70%甲醇溶液，室溫超聲提取1.5 h，冷卻后定容，定容液稀釋10倍過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣檢測。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：274 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相 A：0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相B：色譜乙腈；梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 The table of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的確定

2.1.1 梯度洗脫確定

綠原酸和咖啡堿分別具有弱酸性和弱堿性，文獻(xiàn)稱[19]流動(dòng)相中乙酸濃度對兩者的分離有一定影響，因此本試驗(yàn)參考了GB/T 22250-2008《保健食品中綠原酸含量測定》和2015年版《中國藥典》第一部金銀花中綠原酸含量測定，進(jìn)行梯度洗脫：0～40 min，0.5%乙酸水溶液比例變化為 95%～70%；40 min～45 min，0.5%乙酸水溶液比例變化為70%～95%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 min內(nèi)綠原酸和咖啡堿可以得到很好分離，之后并無其他物質(zhì)出峰，因此確定梯度洗脫比例如下：0～20 min，0.5%乙酸水溶液比例變化為95%～80%；20 min～25 min，0.5%乙酸水溶液比例變化為80%～95%。

2.1.2 檢測波長驗(yàn)證

已知咖啡堿最大吸收波長為272 nm，綠原酸最大吸收波長為327 nm，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]，發(fā)現(xiàn)在274 nm波長條件下，綠原酸和咖啡堿均具有吸收。因此本試驗(yàn)在3個(gè)波長下，分別對綠原酸和咖啡堿混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析（單標(biāo)分析數(shù)據(jù)未列出）。不同波長下綠原酸和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖見圖1。

圖1 不同波長下綠原酸和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖Fig.1 Chromatograms of chlorogenic acid and caffeine at different wavelengths

從圖1-A1、1-A2、1-A3可知，綠原酸出峰時(shí)間為15.65 min，在327 nm下吸收最大，檢測峰面積最高，在274 nm下次之，272 nm下最低；而咖啡堿在327 nm下無吸收，274和272 nm下，檢測峰面積接近，出峰時(shí)間為18.00 min。因此，本方法選擇波長274 nm進(jìn)行檢測。使用該波長對綠咖啡豆提取液進(jìn)行檢測，檢測色譜圖見圖1-B1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系及檢出限

取1.2.2中綠原酸和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.4條件檢測，進(jìn)行線性范圍考察，分別以綠原酸和咖啡堿質(zhì)量濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到綠原酸和咖啡堿的線性回歸方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：綠原酸在5.0 mg/L～100.0 mg/L時(shí)峰面積和濃度成良好線性，r2=0.999 9；咖啡堿在5.1 mg/L～101.6 mg/L時(shí)峰面積和濃度成良好線性，r2=0.999 9。以3倍信噪比（S/N≥3）計(jì)算方法的檢出限（LOD）。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取1.2.2中綠原酸和咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.4條件檢測，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積結(jié)果表明：標(biāo)樣中綠原酸和咖啡堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20%和0.05%（n=5），結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表2 綠原酸和咖啡因的線性范圍、線性關(guān)系及檢出限Table 2 The linear range，linear relation and LODs of chlorogenic acid and caffeine

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

選取同一份樣品，按1.2.3中方法制備5份供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，分別測定色譜峰面積，計(jì)算樣品中綠原酸和咖啡堿含量分別為43.38 mg/g和11.37 mg/g，RSD 分別為 1.56%和 1.30%（n=5），結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

2.2.4 回收率試驗(yàn)

取同一批已知綠原酸和咖啡堿含量的綠咖啡豆樣品，分成3組，分別加入其含量0.8、1.0和1.2倍的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按所建立的方法進(jìn)行樣品處理和測定，結(jié)果表明：綠原酸的回收率為98.86%～101.11%（RSD=1.02%），咖啡堿的回收率為98.70%～101.19%（RSD=0.83%），說明該樣品提取方法可行，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3 不同成熟度綠咖啡豆分析

連續(xù)跟蹤咖啡結(jié)果期5個(gè)月，分別挑選不同成熟度的綠咖啡豆，按1.2.1方法進(jìn)行樣品處理，處理過程見圖2。按1.2.3和1.2.4建立的方法，對干燥后的綠咖啡豆進(jìn)行提取，分別檢測綠原酸及咖啡堿含量，結(jié)果見圖3。

圖2 不同成熟度的綠咖啡豆處理過程Fig.2 The treatment process of raw coffee beans with different maturity

圖3 不同成熟度綠咖啡豆中綠原酸及咖啡堿含量變化Fig.3 The chlorogenic acid and caffeine contents in raw coffee beans of different maturity

可以看出，隨著成熟度的增加，綠咖啡豆中綠原酸含量先快速升高，11月份達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)降低趨勢；而咖啡堿含量，在9月份之后相對穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究建立了一種綠咖啡豆中綠原酸及咖啡堿的同時(shí)定量方法，并使用該方法初步分析了不同成熟度綠咖啡豆各成分含量變化。結(jié)果表明，綠原酸和咖啡堿的線性關(guān)系、檢出限、精密度、重復(fù)性以及加標(biāo)回收率等都滿足檢測需求，方法簡便、快速，檢測設(shè)備要求低，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于綠咖啡豆中綠原酸和咖啡堿含量的測定，可廣泛應(yīng)用于綠咖啡豆產(chǎn)品的質(zhì)量控制。此外，經(jīng)連續(xù)跟蹤分析發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，綠咖啡豆中綠原酸含量先快速升高，達(dá)到峰值后呈現(xiàn)降低趨勢，而咖啡堿含量相對穩(wěn)定，該結(jié)果可為綠咖啡豆的采收提供參考。

[1]王飛,楊晨暉,陳榕.超聲波輔助提取咖啡豆中的綠原酸[J].高校實(shí)驗(yàn)室工作研究,2015(4):44-45

[2]Azuma K,Ippoushi K,Nakayama M,et al.Absorption of chlorogenic acid and caffeic acid in rats after oral administration[J].J Agric Food Chem,2000,48(11):5496-5500

[3]Ky C L,Louarn J,Dussert S.Caffeine,trigonelline,chlorogenic acids and sucrose diversity in wild Coffea arabica L.and C.canephora P.accessions[J].Food chemistry,2001,75(2):223-230

[4]龍文靜.咖啡豆中咖啡因與綠原酸的研究進(jìn)展[J].廣西輕工業(yè),2010,26(1):1-2,112

[5]王立志,胡曉梅,付其勝,等.綠咖啡豆中總綠原酸的純化工藝研究[J].中國食品添加劑,2014(7):123-128

[6]Farah A,Monteiro M C,Calado V.Correlation between cup quality and chemical attributes of Brazilian coffee[J].Food Chemistry,2006,98(2):373-380

[8]Mcdougall B,King P J,Wu B W.Dicaffeoylquinic and dicaffeoyltartaric acids are selective inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 integrase[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1998,42(1):140-146

[9]Shimizu M,Yoshimi N,Yamada Y.Suppressive effects of chlorogenic acid on N-methyl-N-nitrosourea-induced glandular stomach carcinogenesis in male F344 rats[J].The Journal of toxicological sciences,1999,24(5):433-439

[10]Jiang Y,Kusama K,Satoh K.Induction of cytotoxicity by chlorogenic acid in human oral tumor cell lines[J].Phytomedicine,2000,7(6):483-491

[11]Andrade Cetto A,Wiedenfeld H,Revilla M C,et al.Hypoglycemic effect of Equisetum myriochaetum aerial parts on streptozotocin diabetic rats[J].J Ethnopharmacol,2000,72(1-2):129-33

[12]Vinson J A,Burnham B R,Nagendran M V.Randomized,doubleblind,placebo-controlled,linear dose,crossover study to evaluate the efficacy and safety of a green coffee bean extract in overweight subjects[J].Diabetes Metab Syndr Obes,2012,5:21-27

[13]黃雅志.喝咖啡能免除得膽結(jié)石的危險(xiǎn)[J].云南熱作科技,2000(1):23

[14]龍文靜,張盛,袁玲,等.反相高效液相色譜法同時(shí)測定咖啡豆中的6種酚酸類化合物[J].色譜,2011,29(5):439-442

[15]李春麗,賀明鑫.反相液相色譜法測定咖啡豆中咖啡堿含量[J].云南熱作科技,2000(3):10-12

[16]賈桂燕,魯巍巍,鄭毅男.咖啡中咖啡因和綠原酸的含量測定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2008,20(3):64-67

[17]袁鳳琴,王佳,郭建敏,等.高效液相色譜法檢測奶茶粉中咖啡因的含量[J].中國食品工業(yè),2012(6):68-69

[18]楊清山,蔡榮華,徐猛,等.UPLC法測定咖啡豆中綠原酸和咖啡因的含量[J].食品研究與開發(fā),2015,36(18):138-140

[19]蔡榮華,張曉芳,杜精精,等.超高效液相色譜-紫外檢測法同時(shí)測定綠咖啡豆提取物中的綠原酸和咖啡因含量[J].中國食品添加劑,2014(2):225-228

Simultaneous Quantitative Analysis of Chlorogenic Acid and Caffeine in Raw Coffee Beans by HPLC

WANG Guang-lu1，LI Chang-wen1，2，LIU Zhi-da2，LIU Shun-hang2，XU Yong-quan1，*
（1.Tasly Academy，Tianjin 300410，China；2.Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co.，Ltd.，Puer 665000，Yunnan，China）

A high performance liquid chromatography method was developed for simultaneous determination of chlorogenic acid and caffeine in raw coffee beans.The chlorogenic acid and caffeine contents in raw coffee beans of different maturity were analyzed.The separation was performed on a Agilent ZORBAX ODS-C18 column with a gradient elution system.The mobile phase consisted of 0.5%acetic acid solution and acetonitrile.The detection UV wavelength was at 274 nm.The flow rate was 1.0 mL/min.The injection volume was 10 μL.The column temperature was 35℃.The results showed that the linear ranges of chlorogenic acid and caffeine were 5.0 mg/L-100.0 mg/L （r2=0.999 9）and 5.1 mg/L-101.6 mg/L（r2=0.999 9），respectively.The limits of detection（LOD）were 0.25 mg/L and 0.05 mg/L，respectively.The RSDs of the method were 1.56%and 1.30%.The spiked recoveries of the two analytes were 98.86%-101.11%（RSD=1.02%）and 98.70%-101.19%（RSD=0.83%），respectively.

raw coffee bean；chlorogenic acid；caffeine；high performance liquid chromatography（HPLC）；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.030

王光路（1987—），男（漢），研究員，碩士，研究方向：普通食品及保健食品研發(fā)。

*通信作者：徐詠全，高級工程師，碩士。

2017-04-12