響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶提取藍莓多糖工藝研究

孫麗娜，范英兵，胡冬慧，楊源濤，林宇童

（黑河學(xué)院 理學(xué)院，黑龍江黑河164300）

響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶提取藍莓多糖工藝研究

孫麗娜，范英兵*，胡冬慧，楊源濤，林宇童

（黑河學(xué)院 理學(xué)院，黑龍江黑河164300）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化野生藍莓多糖提取工藝，并對多糖的脫色工藝進行優(yōu)化。在單因素的試驗的基礎(chǔ)上，選定酶添加量、酶解時間和酶解溫度三因素三水平，采用Design-Expert軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果分析，得到纖維素酶法提取藍莓多糖的優(yōu)化條件為：酶添加量0.57%，酶解時間85 min，酶解溫度38℃，提取率2.91%；各因素的影響順序為：酶解溫度>酶添加量>酶解時間。

響應(yīng)面法；纖維素酶；藍莓；提取

藍莓，別稱藍漿果、紅豆果、烏飯樹、越桔等，是杜鵑花科越橘屬植物[1]。因其果味鮮美、營養(yǎng)豐富，被譽為“漿果之王”[2]，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[3]。我國野生藍莓主要分布在長白山、大興安嶺和小興安嶺地區(qū)，且大部分在大興安嶺地區(qū)。

藍莓果實中含有原花青素、花色苷、酚酸、微量元素多種活性成分，具有抗癌、強心、明目、防止腦神經(jīng)老化、軟化血管、增強機體免疫力等藥理活性[4-5]。藍莓中也含有多糖成分，糖是重要的生命活性物質(zhì)之一，涉及到人體多細胞生命的全部空間和時間，而多糖作為糖類中的重要一類，又具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老及降血糖等功能[6-7]。由于多糖在提取時，往往成分中含有色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，因此必須要對多糖進行純化。目前，大孔吸附樹脂作為一種廉價、高效的高分子吸附材料，被越來越多的應(yīng)用于多糖的脫色研究[8-9]。

本試驗以黑河地區(qū)野生藍莓味研究對象，探究藍莓多糖的提取的最佳工藝條件，采用大孔吸附樹脂為脫色劑，研究其對藍莓多糖脫色的最佳工藝條件，寄希望本研究為藍莓多糖工業(yè)化的提取及脫色操作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料、試劑與設(shè)備

1.1 材料與試劑

野生藍莓：大興安嶺地區(qū)；纖維素酶（30 U/mg，生化級）：Rubio公司；D101型大孔吸附樹脂：天津市光復(fù)精細化工研究所；無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、乙醇等均為國產(chǎn)分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水。

1.2 設(shè)備

FW-100型粉碎機：上海世邦有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JA20-03N型電子天平：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；DZ-2BCII型真空干燥箱：上海賢德實驗儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型真空抽濾裝置：鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司；DZF6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司

2 方法

2.1 藍莓多糖的提取工藝流程

新鮮藍莓→干燥至恒重→粉碎，過篩→加水50倍攪拌均勻→調(diào)節(jié)pH7.0→加入纖維素酶→100℃滅酶15 min→Sevage法除去蛋白→大孔吸附樹脂脫色→醇沉→抽濾→乙醚、丙酮洗滌抽濾→真空干燥得到藍莓粗多糖→稱重

2.2 藍莓多糖提取的單因素試驗

固定料液（蒸餾水）比為1∶50（g/mL），分別以酶的添加量、酶解時間、酶解溫度為影響因素，進行單因素試驗，考察對藍莓粗多糖提取率的影響。

2.3 響應(yīng)面分析法

在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取合適的因子，進行三因素三水平試驗，以多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分，因素水平表設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 The table of experiment factors and levels optimized by response surface

2.4 藍莓粗多糖提取率的計算

藍莓粗多糖提取率的計算公式如下：

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 酶添加量對藍莓多糖提取率的影響

酶添加量對藍莓多糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶添加量對藍莓多糖提取率的影響Fig.1 The effects of the additive amount of enzyme

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，藍莓多糖提取率增加，這一階段影響藍莓提取率的主要因素是酶含量；在酶添加量達到0.6%時，藍莓多糖的提取率達到了最大；繼續(xù)增大酶添加量，藍莓多糖提取率的增加不明顯，這時影響藍莓多糖提取率的主要因素是底物的量，增加酶用量，藍莓多糖提取率無明顯增加，而且會增大成本。因此，較佳酶添加量0.6%。

3.1.2 酶解時間對藍莓多糖提取率的影響

酶解時間對藍莓多糖提取率的影響如圖2。

圖2 酶解時間對藍莓多糖提取率的影響Fig.2 The effects of the time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

由圖2可知，隨酶解時間的增加，藍莓多糖提取率有明顯增大，但在前90 min內(nèi)增加趨勢明顯。90 min后，反而有所下降。這是由于隨著水解時間的增加，部分多糖水受到破壞。因此，為保證提取率同時保證有效成分完好，較佳酶解時間為60 min左右。

3.1.3 酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響

酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響Fig.3 The effects of the temperature of enzymolysis

由圖3可以看出，酶解溫度40℃時，藍莓多糖的提取率最大，隨溫度的升高，藍莓多糖提取率反而有所下降，主要由于酶活性與溫度有關(guān)，溫度過高，會破壞酶結(jié)構(gòu)，使酶失去活性，溫度過低，酶催化作用不能充分發(fā)揮，因此，較佳酶解溫度在40℃左右。

3.2 響應(yīng)面分析法

3.2.1 響應(yīng)面分析法的設(shè)計

利用Box-Benhnken的設(shè)計原理，共設(shè)計17個試驗點，其中1號～12號是析因設(shè)點，13號～17號零點，析因點為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估算試驗誤差。試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗方案設(shè)計及結(jié)果Table 2 The design and results of Box-Benhnken experiments

以藍莓多糖的提取率為響應(yīng)值Y，通過Design-Expert軟件對響應(yīng)值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程如下：

3.2.2 回歸模型方差分析

回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The result of the variance analysis on regression models

由表3可以看出，模型F檢驗結(jié)果為P=0.000 2<0.01，表明該回歸方程模擬及其顯著，且模型失擬項P=0.568 2>0.05不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.968 2，說明模型擬合程度較好。校正系數(shù)RAdj2=0.927 2說明該模型能解釋92.72%響應(yīng)值的變化，僅有總變異7.29%不能用此模型來解釋。因此，可以用此模型來分析和和預(yù)測纖維素酶提取藍莓多糖的工藝條件。

由表 3 中的方差分析結(jié)果可知，A、B、C、A2、B2、C2對藍莓多糖的提取率影響均顯著，影響的主次順序為C>A>B，即酶解溫度>酶添加量>酶解時間。

3.2.3 最佳條件的確定

酶添加量和酶解時間對藍莓多糖提取率的影響見圖4，酶添加量和酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響見圖5，酶解時間和酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響見圖6。

圖4 酶添加量和酶解時間對藍莓多糖提取率的影響Fig.4 The effects of the addictive amount and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

圖4、圖5、圖6可以看出，酶添加量、酶解時間及酶解溫度的兩兩因素之間對藍莓多糖的提取率影響不大，也就是交互作用不顯著。

響應(yīng)面預(yù)測的最佳試驗組酶添加量為0.57%，酶解時間84.47 min，酶解溫度37.57℃。該條件下藍莓多糖的提取率為2.917 62%。

圖5 酶添加量和酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響Fig.5 The effects of the temperature and addictive amount of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

圖6 酶解時間和酶解溫度對藍莓多糖提取率的影響Fig.6 The effects of the temperature and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

3.3 驗證試驗

為驗證響應(yīng)面試驗的可行性，響應(yīng)面試驗優(yōu)化后得到的最佳反應(yīng)條件進行試驗，考慮到試驗和生產(chǎn)中實際操作的可行性和便利性，酶添加量0.57%，酶解時間75 min，酶解溫度38℃。最佳條件驗證試驗結(jié)果見表4。

表4 最佳條件驗證試驗結(jié)果Table 4 The best condition validation experiment results

由表4可知，3組驗證試驗結(jié)果中平均得率為2.91%。與理論值相差0.076 2%，因此，響應(yīng)面法對纖維素酶輔助提取藍莓多糖的工藝優(yōu)化是可行的。并且具有實際應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本試驗研究采用纖維素酶法提取藍莓多糖，該工藝通過酶水解破壞植物細胞壁的作用，使細胞內(nèi)多糖物質(zhì)充分溶出，從而提高了藍莓多糖的提取率。通過響應(yīng)面試驗可得到：影響因素的順序酶解溫度酶添加量酶解時間；纖維素酶法提取藍莓多糖的最佳條件為：酶添加量0.57%，酶解時間85 min，酶解溫度38℃，提取率達到2.91%。與模型預(yù)估值接近，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型準(zhǔn)確、可靠。試驗所建立的工藝條件酶用量少、條件溫和、材料易得、價格低廉、提取率高，為藍莓多糖的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)。

[1]方仲相,胡君艷.藍莓研究進展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,30(4):599-606

[2]胡雅馨,李京,惠伯棣.藍莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J].食品科學(xué),2006,27(10):600-603

[3]顧姻,賀善安.藍漿果與蔓越桔[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001

[4]孫貴寶.藍莓的保健作用及各國栽培發(fā)展趨勢[J].農(nóng)機化研究,2002(3):225

[5]李穎暢,孟憲軍.藍莓果主要物質(zhì)含量及處理方式對花色苷的影響[J].食品工業(yè)科學(xué),2008,29(5):163-164

[6]王秀菊.藍莓干酒及藍莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2010

[7]李穎暢,王亞麗,齊鳳元,等.響應(yīng)面法優(yōu)化藍莓葉多糖提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2015,36(3):227-231

[8]黃顯章,馮蕓,尹玲,等.大孔吸附樹脂用于葛根美容添加劑提取液的脫色研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(8):2077

[9]姚文華,尹卓容.大棗多糖脫色的工業(yè)化研究[J].天然產(chǎn)物分離,2006,4(1):6

[10]楊麗勇.藍莓的營養(yǎng)保健功能及其產(chǎn)品開發(fā)[J].中國食物與營養(yǎng),2007(4):24-25

[11]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999

[12]孫磊,喬善義,趙毅民.黑骨藤多糖含量測定方法研究[J].中國中藥雜志,2009,34(10):1241-1244

Optimization of Cellulose Extraction of Blueberry Polysaccharide by Response Surface Methodology

SUN Li-na，F(xiàn)AN Ying-bing*，HU Dong-hui，YANG Yuan-tao，LIN Yu-tong
（College of Science，Heihe College，Heihe 164300，Heilongjiang，China）

The extraction process of wild blueberry polysaccharide was optimized by response surface methodology，and the decolorization process of polysaccharide was optimized.On the basis of single factor test，the three factors and three levels of enzyme addition，enzymolysis time and enzymolysis temperature were selected.The design experiment and result analysis were carried out by using Design-Expert software to obtain the method of enzymatic extraction of blueberry polysaccharide The optimum conditions were as follows：enzyme addition amount 0.57%，enzymolysis time 85 min，enzymolysis temperature 38℃，extraction rate 2.91%；the influence order of each factor was：enzymolysis temperature>enzyme dosage>enzymolysis time.

response surface methodology；cellulose；blueberry；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.010

黑河學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究重點項目（KJZ201502）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201613744022）

孫麗娜（1983—），女（漢），助教，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué)。

*通信作者：范英兵（1984—），男，講師。

2017-05-03