大鼠骨髓間充質干細胞在心肌缺血微環境中Cav1.2的表達

張 靜,馬愛群,魏 峰,王亭忠

(1新疆醫科大學第四附屬醫院心臟中心,烏魯木齊 830000;2西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科；*通訊作者,E-mail:wz200811@126.com)

大鼠骨髓間充質干細胞在心肌缺血微環境中Cav1.2的表達

張 靜1,馬愛群2*,魏 峰2,王亭忠2

(1新疆醫科大學第四附屬醫院心臟中心,烏魯木齊 830000;2西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科；*通訊作者,E-mail:wz200811@126.com)

目的 觀察大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在心肌缺血微環境中向心肌細胞分化過程中Cav1.2的分化表達。 方法 采用左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)結扎術建立大鼠急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型(n=52),并行心電圖檢查。將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記MSCs,貼壁培養,用心外膜下注射法將GFP標記的MSCs移植到心肌梗死周邊區域;移植后7 d開胸取心臟組織,HE染色觀心肌梗死區域病理變化。將移植后3，5，7 d的大鼠分為3 d組、5 d組、7 d組,每組10只動物,免疫熒光染色觀察各組移植的MSCs上Cav1.2蛋白的表達;激光捕獲顯微切割技術分離各組心肌組織中GFP標記的MSCs群,應用real-time PCR測定各組心肌組織中Cav1.2及未移植大鼠MSCs mRNA的相對表達量;移植后9 d,對移植區域行TUNEL凋亡染色。 結果 免疫熒光染色觀察3 d組、5 d組、7 d組心肌組織中移植的MSCs均不表達Cav1.2;real-time PCR測定顯示,3 d組、5 d組、7 d組中Cav1.2相對表達量與未移植的MSCs相比均無明顯變化(P>0.05),移植后9 d未觀察到MSCs的表達,TUNEL凋亡染色顯示移植的MSCs發生了凋亡。 結論 在大鼠心肌缺血微環境中移植的MSCs不表達Cav1.2且不能長期存活。

心肌梗死; 骨髓間充質干細胞; 移植; Cav1.2

干細胞是一類具有自我復制與分化潛能的細胞,通過特定誘導能夠分化出相應心肌細胞替代受損或壞死的宿主心肌細胞,從而不同程度改善心臟功能[1]。大量動物實驗[2,3]表明,心肌梗死區域局部移植MSCs的可向心肌細胞分化,但干細胞作為外源性物質移植入心臟的安全性存在質疑,尤其是導致心律失常方面存在爭議,有研究[2]觀察到心肌梗死患者接受MSCs移植后會發生心律失常。心律失常的發生發展與心肌中離子通道的分化表達有重要關系,鈣離子通道對心肌細胞動作電位的產生、傳導和維持動作電位時間等起到重要作用。其中,Cav1.2作為心肌主要L型鈣通道之一,是細胞興奮時鈣內流最主要的途徑,在心肌動作電位的產生、興奮收縮偶聯、激素和神經遞質的分泌、釋放等過程中起著重要的調節作用[4]。因此,移植后的MSCs是否具有鈣離子通道的電生理特性對于移植后心臟是否發生心律失常起到至關重要的作用,本文擬研究MSCs移植到大鼠心肌缺血微環境中是否表達Cav1.2,為移植后心律失常發生的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80 g清潔級雄性SD大鼠1只用于骨髓供體,180-200 g清潔級雄性SD大鼠52只用于建立MI模型,均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。所有動物均獲得動物實驗管理委員會的批準,并符合動物實驗管理條例和美國NIH發布的實驗動物應用和保護指南。

1.2 主要儀器及試劑

激光顯微切割儀購于瑞士LEICA公司,BX51型光學顯微鏡購于日本Olympus公司,兔抗大鼠Cav1.2抗體購于美國Santa cruz公司,山羊抗兔IgG-Cy3購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 MSCs的分離、標記

采用Percoll’s密度梯度離心法結合貼壁培養法分離純化MSCs,采用文獻[5]的方法,以攜帶GFP的慢病毒載體轉染標記,并傳代培養。

1.4 MI模型的建立

100 g/L水合氯醛以3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉SD大鼠(n=50),常規備皮、消毒、鋪巾,剪開皮膚,鈍性分離,血管彎鉗撐開肋骨,適當用力將心臟擠出,在平左心耳下緣2 mm處,以7/0無損傷縫合線結冠脈前降支近端,心電圖觀察心肌梗死后ST段的改變,待心率、心律及呼吸正常且平穩后,縫合皮膚,術后連續3 d肌肉注射青霉素鈉。

1.5 GFP標記的MSCs的體內移植

將成功建立MI模型的46只大鼠接受MSCs移植,采用建立MI模型的同樣方法麻醉、開胸、暴露心臟,用1 ml胰島素注射器于心肌梗死局部發白區即MI周邊區圓周分布均勻迅速注射MSCs細胞懸液,注射后的心臟歸位。

1.6 實驗分組及處理方法

將成功建立移植模型的36只大鼠于移植后第3，5，7，9天分別隨機處死10，10，10，6只。第3，5，7天處死的10只中,5只用于HE染色及免疫熒光染色,5只用于real-time PCR法檢測,第9天處死的6只,用于TUNEL凋亡染色。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 心肌梗死前后心電圖的改變

LAD結扎前示心電圖正常(見圖1A);結扎后5 min示ST段抬高,大于0.3 mV(見圖1B);結扎后30 min出現病理性Q波(見圖1C)。

A.LAD結扎前 B.LAD結扎后5 min C.LAD結扎后30 min圖1 心肌梗死前后不同時期心電圖的變化Figure 1 Electrocardiogram changes before and after myocardial infarction

2.2 心肌大體標本及梗死區域病理學變化

心肌梗死部位顏色發白(見圖2A),心臟橫切面、梗死區域室壁明顯變薄且成透亮白色(見圖2B)。HE染色示梗死區域大量纖維及膠原組織增生,肌纖維排列紊亂,間質網絡結構破壞,肌絲斷裂(見圖2C)。

2.3 移植的MSCs局部分布特點及Cav1.2的表達

通過免疫熒光顯微鏡觀察移植的GFP標記的MSCs,在心肌組織內排列方向與心肌細胞一致,呈帶狀分布,通過Cav1.2的免疫熒光染色觀察到于移植后3，5，7 d數量遞減趨勢,均無Cav1.2的表達(見圖3)。

2.4 GFP標記的MSCs移植前后mRNA的表達

移植的MSCs上Cav1.2在移植后3，5，7 d之間比較及與未移植的MSCs相比,其相對表達量均無明顯變化(P>0.05,見圖4)。

2.5 TUNEL凋亡染色

移植的MSCs數量逐漸減少,移植后9 d,MSCs細胞數量明顯減少,觀察不到其的存活,移植區域行TUNEL凋亡染色示移植區域的GFP標記的MSCs在光鏡下呈棕褐色(見圖5),提示移植的MSCs發生了凋亡。

A.心臟大體形態改變B.心臟橫切面C.心肌梗死區(HE染色×200)圖2 MI模型7 d心臟大體形態及組織病理學改變Figure 2 General gross and pathological changes of the AMI model at day 7 after infarction

A.移植后3 d B.移植后7 d圖3 心肌組織中GFP標記的MSCs上Cav1.2的免疫熒光染色 (×600)Figure 3 The transplanted GFP-labeled MSCs in vivo by immunofluorescence staining (×600)

圖4 不同移植時間及未移植MSCs中Cav1.2 mRNA的相對表達Figure 4 Relative expression of Cav1.2 mRNA in transplanted MSCs and non-transplanted MSCs

3 討論

正常心肌細胞的動作電位主要由鉀、鈉、鈣離子的跨膜流動形成,其中,心肌細胞通過L-型鈣通道的慢向Ca2+內流構成心室肌細胞動作電位平臺期的基礎。本實驗小組前期實驗已證實移植的MSCs在體內心肌缺血微環境中可表達cTnI、MYH、Cx43等部分心肌細胞特異性標志物,說明移植的MSCs在形態學上能夠朝心肌細胞方向分化,但本實驗結果提示移植的MSCs不能表達Cav1.2,即不能獲得正常心肌細胞主要鈣離子通道的電生理特性,Cav1.2鈣通道是心肌細胞興奮時鈣內流的主要途徑,對細胞的生理機能起到至關重要的作用。心肌細胞內鈣的濃度分布及時相變化等直接影響細胞收縮功能、節律變化、細胞生長及死亡,與心律失常的發生相關。

A.移植9 d時移植MSCs的區域 B.相同移植部位的MSCs凋亡染色后呈棕褐色圖5 移植9 d后TUNEL凋亡染色 (×200)Figure 5 TUNEL staining of the apoptosis in transplanted zone at day 9 (×200)

大量的動物證實移植的MSCs的分化具備環境誘導依賴性[6]。移植的MSCs所處環境是病態環境,周圍既有正常的心肌細胞,也有受損或異常的心肌細胞以及纖維瘢痕組織等,MSCs具有多向分化潛能,可以向受損或異常的心肌細胞或者纖維瘢痕組織分化,微環境的異質性可能會影響MSCs向正常心肌細胞分化,除此而外,Cav1.2周圍相互作用蛋白的表達異常也影響其表達及電生理特性[7]。本實驗證實移植的MSCs在體內心肌缺血微環境中不表達Cav1.2,其表達缺失是由于離子通道本身還是其相互作用蛋白的異常所致尚不明確。Cav1.2表達異常可能會增加移植MSCs與宿主心肌細胞間電生理耦聯的異質性,可能會引起異常的心電活動,可能是MSCs移植導致宿主心律失常的主要原因之一[8,9]。

另外,隨著MSCs移植入體內的時間延長,存活的MSCs數量逐漸減少,本實驗證實其在心肌缺血微環境中發生了凋亡,既往有動物實驗證實MSCs移植后24 h,50%以上的移植細胞發生了凋亡,7 d后超過90%的移植細胞發生了凋亡[10],推測其原因與心肌梗死后心肌局部微環境缺氧缺血、移植區域自由基的產生、炎性反應等使梗死周邊釋放大量炎性因子和凋亡因子促進移植的MSCs凋亡相關[11-13],MSCs移植后發生凋亡也可以影響Cav1.2的正常表達,因此,怎樣誘導MSCs移植后Cav1.2的表達,從而避免心律失常的發生,有待進一步研究。

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TheexpressionofCav1.2inratallogeneicmesenchymalstemcellsinthemicroenvironmentofmyocardialischemia

ZHANG Jing1,MA Aiqun2*,WEI Feng2,WANG Tingzhong2

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,FourthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversityMedicalSchool;*Correspondingauthor,E-mail:wz200811@126.com)

ObjectiveTo observe the expression of Cav1.2 of allogeneic mesenchymal stem cells(MSCs) in microenvironment of rat myocardial ischemiainvivo.MethodsThe myocardial infarction(MI) rat models were established by ligating the left anterior descending coronary artery(LAD). The MSCs were labeled by green fluorescent protein(GFP) and cultured using direct adherent culture methods. GFP-labeled MSCs were injected into the surrounding area of the epicardium myocardial infarction(n=52). Then the gross specimens were observed and HE staining was performed on infarct areas after transplantation for 7 d. The rats were divided into three groups according to transplantation time:3 d group, 5 d group and 7 d group. The protein expression of Cav1.2 in each group was observed by immunofluorescence staining, and the relative mRNA was acquired by laser capture microdissection and measured by real-time PCR. The transplanted areas were observed by TUNEL staining at day 9.ResultsThe transplanted MSCs did not express Cav1.2 at day 3, 5, 7.Compared with non-transplanted MSCs, the relative expression of Cav1.2 showed no significant changes at day 3, 5, 7 by real-time PCR in the transplanted MSCs(P>0.05), and the expression of Cav1.2 was not observed at day 9 by TUNEL staining, but there was apoptosis in the transplanted MSCs.ConclusionThe transplanted allogeneic MSCs could not express Cav1.2 in the microenvironment of myocardial ischemia, and could not effectively survive for a long time.

myocardial infarction; mesenchymal stem cell; transplantation; Cav1.2

國家自然科學基金資助項目(30800455)

張靜,女,1984-07生,碩士,主治醫師,E-mail:303918935@qq.com

2017-08-07

R36

A

1007-6611(2017)11-1092-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.002