細鱗魚殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的分離鑒定

單曉楓 ， 康元環 ， 吳同壘 ， 孫武文 ， 張冬星 ， 賈俊鵬 ， 劉艷輝 ， 錢愛東

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點試驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 3.吉林省水產科學研究院 ， 吉林 長春 130000)

細鱗魚殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的分離鑒定

單曉楓1， 康元環1， 吳同壘2， 孫武文1， 張冬星1， 賈俊鵬1， 劉艷輝3， 錢愛東1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點試驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 3.吉林省水產科學研究院 ， 吉林 長春 130000)

為確定吉林省某漁場細鱗魚發病死亡的病因，本研究由瀕死的細鱗魚體內分離出一株優勢菌，經動物回歸試驗，該菌株對細鱗魚具有致病性，將其命名為BRL-15。經菌體、菌落形態，理化特性，16S rRNA基因序列分析，鑒定菌株BRL-15為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。藥敏試驗結果顯示，該菌株對所選抗菌藥物中絕大多數高度敏感。試驗結果為細鱗魚殺鮭氣單胞菌病的防治提供一定理論依據。

細鱗魚 ； 殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種 ； 分離鑒定 ； 藥敏試驗

細鱗魚隸屬于鮭形目、鮭科、細鱗魚屬，其生活在亞洲東北部，是一種冷水性魚類。我國只有一屬一種，主要分布在西北、東北和華北的某些河流中[1]。細鱗魚是國家二級保護水生野生動物，在魚類學與動物地理學上具有重要學術研究價值。此外，細鱗魚營養價值較高，還具有可以防止血栓生成、加快傷口愈合等藥用功能，而受到人們喜愛[2]。但是，由于人類活動范圍擴大、捕撈過度等原因，該魚已處于瀕臨滅絕的狀態。為了保護這一名貴的魚類資源，我國已在吉林省圖們江流域、黑龍江省牡丹江流域、陜西省秦嶺地區等地建立了細鱗魚自然保護區，并進行人工的規模化養殖[3]。

隨著細鱗魚馴養繁殖過程的深入，出現了各種疫病，制約了其發展。目前，已有報道的細鱗魚疾病包括腸炎病、爛鰓病、水霉病、三代蟲病等多種。2016年6月，吉林省延邊朝鮮族自治州某養殖場的細鱗魚體側及尾部出現膿腫，甚至形成潰瘍，并有部分死亡現象。試驗室從瀕死魚體內分離出1株優勢菌株，經動物回歸試驗證實其有致病性，通過理化鑒定、16S rRNA基因序列分析確定其種屬，并對菌株進行了藥敏試驗。研究結果細鱗魚潰瘍病的防治提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 患病細鱗魚、健康細鱗魚，均取自吉林省延邊朝鮮族自治州某漁場；RS培養基，購自北京陸橋生物技術有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL-2 000 Marker,購自TaKaRa公司；微量生化反應管、藥敏紙片,購自杭州微生物試劑有限公司；其余均為國產或進口分析純。

1.2 病原菌的分離純化 無菌操作，取瀕死細鱗魚的肝臟、心臟等組織，劃線接種于RS瓊脂平板，28 ℃培養24 h，挑取形態一致的優勢菌落，再次劃線培養24 h，挑取單個菌落進行純培養，并對純化的細菌進行革蘭染色，觀察菌體形態。

1.3 動物回歸試驗 將純化的細菌用無菌PBS稀釋至1.55×108CFU/mL，以每尾0.2 mL的劑量腹腔注射感染健康細鱗魚，同時設置對照組，腹腔注射0.2 mL的無菌PBS，每組感染10尾。飼養水溫保持在20 ℃、并保證溶氧充足。持續觀察7 d，記錄細鱗魚發病死亡情況，并對病死魚進行細菌分離培養。

此外，采集自然發病的瀕死魚心臟、肝臟等組織，5倍量添加無菌PBS(1g∶5 mL)，進行組織研磨且反復凍融，12 000 r/min離心15 min取上清，上清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液經無菌檢驗后接種健康細鱗魚，感染劑量、方法與魚尾數同上。

1.4 生理生化鑒定 挑取分離株純培養物，接種于微量生化反應管中，具體操作及結果判定標準見微量生化反應管說明書。

1.5 16S rRNA基因擴增及系統發育分析 熱裂解法提取病原菌分離株的基因組，并以此為模板，擴增16S rRNA基因序列，引物為16S rRNA通用引物：P1：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′、P2：5′- GTGTGACGGGCGGTGTGTA-3′，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min、30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化回收后由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

測序結果經NCBI數據庫BLSAT比對相似性，并用MEGA6.0軟件構建系統發育樹進行比較分析。

1.6 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B紙片法，將病原菌活菌擴增，并將菌濃度調成1.5×107CFU/mL。取0.1 mL菌液涂布于TSA瓊脂平板，選取20種藥敏紙片，貼于上述平板，28 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑，依據CLSI標準，對藥敏結果進行判定。

2 結果

2.1 細菌的分離及菌落菌體形態 從患病瀕死細鱗魚體內分離出1株優勢菌，命名為BRL-15。該菌在RS培養基上為圓形、邊緣整齊的黃色菌落。革蘭染色為革蘭陰性短桿菌、兩端鈍圓、單在或雙在(見中插彩版圖1)。

2.2 動物回歸試驗 將菌株BRL-15腹腔接種細鱗魚，在4 d內全部發病死亡，對照組無異常。剖檢病死魚，其病理變化與自然病死魚相同，從其體內也分離出與BRL-15菌落、菌體、理化特性相同的細菌。

將組織濾液接種細鱗魚，并未出現發病等現象，說明這次引起細鱗魚死亡的病原是細菌感染而非病毒。

2.3 理化鑒定結果 菌株BRL-15葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、半乳糖、ONPG、膽汁七葉苷、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、氰化鉀生長等結果陽性；乳糖、阿拉伯糖、阿拉伯醇、木糖、山梨醇、肌醇、尿素、靛基質、硫化氫、枸櫞酸鹽、運動性等結果為陰性；與《伯杰氏細菌鑒定手冊》比對，基本符合殺鮭氣單胞菌特性，初步判定其為殺鮭氣單胞菌。

2.4 16S rRNA基因序列與系統發育分析 PCR擴增菌株BRL-15的16S rRNA基因片段經電泳檢測約1 400 bp(圖2)，測序結果顯示，該片段長1 403 bp，將基因序列進行同源性檢索，同時選取不同氣單胞菌種屬代表株及BRL-15菌株的16S rRNA基因序列構建系統發育樹(圖3)，結果顯示，菌株BRL-15 16S rRNA基因序列與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種同源性達99%以上。

綜合菌體、菌落形態，理化特性與16S rRNA基因序列分析結果顯示，菌株BRL-15為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

圖2 菌株BRL-15 16S rRNA PCR擴增結果

圖3 分離菌株BRL-15 16S rRNA基因序列發育進化樹

2.5 藥敏試驗 菌株對20種抗菌藥物的敏感性試驗結果表明，該菌株除對強力霉素、多黏霉素B中度敏感外，其余18種抗菌藥物均高度敏感(表1)。

3 討論

殺鮭氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，其下有5個亞種，分別是殺鮭亞種、無色亞種、殺日本鮭亞種、史氏亞種和溶果膠亞種[4]。該菌分布廣泛，可以引發多種水生動物發病，尤其是鮭科魚類更易感染，感染魚體會出現皮膚潰瘍等癥狀，嚴重者會引起死亡[5]。本研究從患潰瘍細鱗魚體內分離出一株細菌即是殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種，該菌經動物回歸試驗顯示，對細鱗魚具有致病性，并與自然發病者癥狀一致。此外，本研究對病魚組織進行了研磨、離心、取上清，并用此上清進行了攻毒試驗，結果顯示，細鱗魚并未發病。綜合以上試驗證明，此次細鱗魚潰瘍病的病原為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。而究其感染原因可能是發病前期當地氣溫發生驟變、加上部分魚體受傷，致使魚機體免疫力下降，其自身攜帶的細菌感染導致發病，并迅速傳染同池細鱗魚，致使疾病暴發。

表1 分離菌株BRL-15的藥敏試驗結果

S：高度敏感；I：中度敏感

殺鮭氣單胞菌的5個亞種之間的理化特性區別不大[6]，為更準確的鑒定，本試驗通過PCR擴增出菌株BRL-15的16S rRNA基因序列，通過BLSAT的比對以及系統發育樹分析：其與GenBank上公布的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種16S rRNA基因序列的同源性在99%以上，且系統發育樹顯示，菌株BRL-15與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種聚為一支。綜合菌落菌體形態、理化特性、16S rRNA基因序列分析，菌株BRL-15最終確定為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

目前，國內魚類大部分細菌病的治療仍以抗生素為主，因此，為篩選合適的抗生素治療該病，本研究對菌株BRL-15進行了藥敏試驗。令人欣慰的是：菌株BRL-15對試驗所選的絕大部分藥物均比較敏感，這與異育銀鯽源、鯉魚源殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種的耐藥性有一定區別[7-8]，與同樣為細鱗魚的病原菌殺鮭氣單胞菌無色亞種的耐藥譜也區別較大[1]。這可能與菌種不同、菌株來源地點不同有一定關聯。此外，本試驗所用細鱗魚所屬的養殖場為山泉流水養殖，水環境優良、受到抗生素的污染較少，魚的抵抗力相對較強，而此次發病，如上所討論，可能是氣溫變化較為劇烈，加上換池導致的魚體受傷所致。因此，菌株BRL-15的藥敏試驗結果是對試驗所選絕大多數藥物敏感。

為防治細鱗魚潰瘍病的發生，除加強日常管理、盡量避免魚體受傷外，如果研制其病原的滅活疫苗或其他優質疫苗，則可以更好預防該病的發生，還可以減少抗生素的使用，進而降低耐藥菌株出現的風險，減少食品中藥物殘留的危害。

[1] 劉寧，時曉，杜迎春，等.患病細鱗魚殺鮭氣單胞菌的分離與鑒定[J].淡水漁業,2015,45(1):88-92.

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[3] 白亞榮，武二栓，宗振東，等. 細鱗魚人工繁育及大型水域放流增殖技術[J].內蒙古農業科技, 2015,43(5):101-103.

[4] Nash J H E, Findlay W A, Luebbert C C,etal. Comparative genomics profiling of clinical isolates ofAeromonassalmonicidausing DNA microarrays [J].BMCGenomics， 2006,7: 43

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[8] 王海娟，王利. 鯉魚殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫，2015,42(1):192-196.

IsolationandidentificationofAeromonassalmonicidasubspSalmonicidafromBrachymystaxlenok

SHAN Xiao-feng1, KANG Yuan-huan1, WU Tong-lei2, SUN Wu-wen1, ZHANG Dong-xing1, JIA Jun-peng1, LIU Yan-hui3, QIAN Ai-dong1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Hebei Normal University of Science amp; Technology, Hebei Province Key laboratory of Veterinary Proventive Medicine, Qinhuangdao 066004,China; 3.Jilin Province Research Institute of fisheries science,Changchun 130000,China)

To identify the cause of disease from theBrachymystaxlenokin Jilin Province,the pathogenic strain was isolated from moribundBrachymystaxLenok. A purely cultured strain (BRL-15) causedBrachymystaxlenokinfected. It was identified asAeromonassalmonicidasubsp.salmonicidaaccording to its morphological, and physiobiochemical characteristics, and 16SrRNA sequencing. The result of drug susceptibility test showed that the isolatesensitive was to most antibiotics. These results provide a scientific basis for treatment ofBrachymystaxLenokinfected withAeromonassalmonicida.

BrachymystaxLenok;Aeromonassalmonicidasubsp ;Salmonicida; isolation and identification ; Drug resistance

s: QIAN Ai-dong ; LIU Yan-hui

S943.121

A

0529-6005(2017)10-0091-03

2017-03-04

國家自然科學基金項目(31201927)；吉林省重點科技攻關項目(20150204065NY)；吉林省科技廳自然基金項目(20170101016JC)

單曉楓(1977-)，男，副教授，博士，從事動物細菌學方面的研究，E-mail: sxf1997@163.com

錢愛東，E-mail: qianaidong0115@163.com；劉艷輝，E-mail: liuyanhui9@163. com