杜仲葉部內生真菌的抗氧化活性測定以及菌株鑒定

劉 洋,張弘弛

(山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009)

杜仲葉部內生真菌的抗氧化活性測定以及菌株鑒定

劉 洋,張弘弛

(山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009)

本研究利用體外清除DPPH自由基的方法，測定了5株杜仲葉部內生真菌的抗氧化活性。通過插片培養，性狀觀察，顯微攝影和分子鑒定對抗氧化活性高的杜仲內生真菌進行了分類研究。研究表明，這些杜仲內生真菌對DPPH清除率具有劑量依賴性，其抗氧化能力隨樣品濃度的增加呈增長趨勢。在濃度為0.5 g/mL時，其中對DPPH自由基清除率在95 %以上的菌株有1株(EL05)，經鑒定屬于曲霉屬。

杜仲；內生真菌；抗氧化活性；顯微攝影；ITS序列

杜仲Eucommia ulmoides 是杜仲科杜仲屬植物，為我國特有的珍貴樹種，其樹皮經過干燥可入藥，是名貴的滋補藥材[1]。杜仲含有多種天然藥物化學成分，包括木質素、苯丙素、黃酮、多糖、脂肪酸等[2]。研究表明內生真菌幾乎存在于所有的植物體[3]，其受到植物組織的良好保護，與寄主植物協同進化，內生真菌可從宿主植物中吸收營養，也可通過自身的代謝產物或借助于信號轉導作用對植物產生積極影響[4]。

本論文研究的目的是從杜仲內生真菌中尋找可以產生抗氧化活性物質的內生真菌，為天然抗氧化劑的來源提供另一生物資源，為緩解中藥資源日益減少與藥用植物資源需求量的不斷增加之間的矛盾提供新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DPH-600電熱恒溫培養箱，金壇市國旺實驗儀器廠；SHZ-D(III)循環水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；JA5003B千分之一電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；Boxun超凈工作臺，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；Mult I skan FC酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；LS-7SHD型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫療設備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱，上海晶壇儀器制造有限公司。

甲醇，無水乙醇，乙酸乙酯，DPPH(0.2 mmoloL-1，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，別名1,1-二苯基-2-苦肼基)，1 %的水溶性苯胺藍，苯酚，甘油，所有試劑均為分析純。

1.2 材料和培養基

前期實驗篩選出的5株源自杜仲葉部的產黃酮的內生真菌(EL01-EL05)，保存于山西大同大學應用生物技術研究所。

察氏(固體)培養基：NaNO31 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.25 g，MgSO40.25 g，FeSO40.005 g，葡萄糖15 g，(瓊脂10 g)，蒸餾水1000 mL，121 ℃，滅菌25 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 內生真菌的發酵和產物提取

杜仲葉部內生真菌經平板活化后，接種于含100 mL察氏液體培養基的250 mL錐形瓶中(10瓶)，28 ℃，150 r·min-1振蕩培養15 d，發酵濾液減壓濃縮至100 mL以下，然后用乙酸乙酯萃取3次，濃縮后得粗提物配置成1 g·mL-1的樣品。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定[5]

96孔板稀釋：取樣品100 μL置于96孔板的各排的第一孔中，其余11孔中均加入90 μL甲醇，將第一孔中取10 μL加入第二孔中，依次將樣品以10-1倍進行稀釋，最后一孔取10 μL棄掉。然后在每孔中加入90 μL DPPH構成180 μL測定體系，測得的數據取平均值為(Ai)。

同樣方法，96孔板每排的第一孔中加入各樣品100 μL，然后在每排的其余各孔中均加入90 μL甲醇，從第一孔取10 μL樣品加入第二孔，以10-1倍進行稀釋，但不加DPPH，此為樣品對照，記錄數據為(Aj)。

取90 μL甲醇，90 μL的DPPH，作為空白對照測定吸光度。在96孔板的每塊板上，取3個孔加入上述試劑，記錄數據取均值為(Ac)。維生素C(Vc)為陽性對照。按公式：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，計算清除率。

1.3.3 顯微攝影的實驗方法[6]

插片培養：將4 ℃冰箱保藏的5株杜仲葉部內生真菌菌株用接種環挑取少量孢子(菌絲)，在平板培養基上以“Z字”劃線接種，然后以無菌接種于平板中，并在平板中插入無菌蓋玻片(以30°-40°角插入，深度約為蓋玻片的1/3長度)。28℃，置于恒溫培養箱培養。

性狀觀察：每隔一段時間(12h或者24h)觀察。

制片檢查：將蓋玻片用鑷子取出，滴一滴1%的水溶性苯胺藍在合適的插片上靜置15min，并以乳酚油為浮載劑。

1.3.4 分子鑒定[7]

活性內生真菌接種于察氏固體平板上，培養時間12 d，無菌低溫(液氮)研磨菌絲和孢子至粉末，CTAB法提取真菌DNA，然后以基因組DNA為模板，PCR擴增該菌株DNA序列。PCR 擴增產物送三聯兄弟生物醫藥研究(北京)有限公司測序，序列結果通過Blast比對分析，構建聚類分析圖。

2 結果與討論

3.1 杜仲葉部內生真菌對DPPH 的清除效果

抗氧化實驗結果表明，杜仲葉部內生真菌的清除DPPH的能力隨樣品濃度的增加呈增長趨勢(圖1)。在樣品質量濃度為0.5 ×10-4g·mL-1以下，各內生真菌的抗氧化活性差異性不明顯；樣品濃度在0.5×10-3g·mL-1至0.5 g·mL-1之間，EL04的抗氧化活性增長緩慢，其他菌種出現快速增長；在樣品質量濃度為0.5 g·mL-1時，有2株菌株(EL03和EL05)表現出極高的清除DPPH自由基的能力，清除率在90%以上，表明這2株菌株在質量濃度為0.5 g·mL-1時，DPPH已大致上被清除掉了；對DPPH自由基清除率在80%～90%的菌株有1株(EL01)；清除率在70%～80%的有1株(EL02)；清除率小于70%的有1株(EL04)；其中(EL05)的清除效果最佳，高達95.2%，而(EL04)的清除效果最弱僅為68.5%。

圖1 不同質量濃度下對DPPH自由基的清除率

Fig.1 DPPH free radical at different concentrations

3.2 高抗氧化活性杜仲內生真菌的菌落特征及菌種鑒定

圖2 EL05菌落形態及菌絲(×10)和孢子形態(×40)Fig.2 The colonial morphology of the strain EL05

圖3 菌株EL05菌落形態和系統發育分析Fig.3 The polymeric analysis of strain EL05

EL05的菌落特征：菌落菌落為乳白色，其上生有褐色隔膜，便于小顆粒孢子團附著，菌絲有爬壁現象，培養基質呈淺褐色。菌絲表面有有色物質、有隔膜，分生孢子梗直立，頂端膨大成球形，上生1-2層放射狀分布的瓶狀小梗，分生孢子梗較長，有隔膜，頂端有分枝，其上著生的串生分生孢子為球形(圖2)。PCR 擴增后的ITS序列長604bp，聚類分析圖(圖3)分析該菌株與多株Aspergillus sp.聚合在一起，因而EL05與Aspergillus sp.具有同源性，結合形態學分析(菌落觀測和顯微觀察)和ITS序列分析，EL05被鑒定為Aspergillus sp.。

3 結論

目前的抗氧化劑大多從植物中提取，從植物內生真菌中提取抗氧化劑并不多[8-9]。本文對5株杜仲葉部內生真菌的抗氧化活性進行了研究，發現其在體外表現出較佳的對DPPH自由基的清除能力。尤其是菌株EL05，清除率高達95.2%，這為我們以后的實驗研究提供了理論依據。此外還發現杜仲葉部內生真菌的次級代謝產物對DPPH的清除率具有劑量依賴性。由于濃度的變化其清除DPPH的能力也會發生相應的改變，而且是遞增的。此外，對活性菌株的鑒定結果表明，抗氧化能力在95%以上的菌株EL05屬于曲霉屬。

因此，通過此次對杜仲內生真菌抗氧化活性的研究，發現其在天然抗氧化劑開發方面具有一定的潛力，為天然抗氧化劑的來源提供新思路。

[1] 江蘇新醫學院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海科學技術出版社,1986:2090．

[2] 管淑玉,蘇薇薇.杜仲化學成分與藥理研究進展[J].中藥材,2003,26(2):124-129．

[3] 郭良棟.內生真菌研究進展[J].菌物系統,2001,20(1):148-152．

[4] Huang W Y, Cai Y Z, Xing J, et al. A potential antioxidant resource: endophytic fungus from medicinal plants [J]. Economic Botany, 2007, 61(1): 14-30.

[5] Kusari S, Lamshoft M, Zuhlke S, et al. An endophytic fungus from Hypericum perforatum that produces hypericin[J]. Journal of Natural Products, 2008, 71(2): 159-162.

[6] 劉 瑞,張弘弛,李 慧,等.一株恒山產蒙古黃芪內生真菌Penicillium griseofulvum次生代謝產物的分離和菌種鑒定[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22 (16):25-29.

[7] 張弘弛,劉 瑞,李 慧,等.恒山黃芪內生真菌Rhizopus sp.次生代謝產物的分離和鑒定[J]. 中國實驗方劑學雜志,2017,23(4):68-72.

[8] 錢 龍,楊明飛,冉雪琴,等.銀杏產黃酮內生真菌的分離與鑒定[J].山地農業生物報,2007,26(4):305-310.

[9] 朱欣婷,劉 云,李常春.粉背雷公藤內生真菌抗氧化活性的初步研究[J].中國民族民間醫藥,2012,21(18):46-47.

(本文文獻格式：劉洋,張弘弛.杜仲葉部內生真菌的抗氧化活性測定以及菌株鑒定[J].山東化工，2017，46(20)：80-81，84.)

AntioxidantActivityofEndophyticFungithatProduceFlavonoidsfromEucommiaUlmoidesandIdentificationofStrains

LiuYang,ZhangHongchi

(College of Life Science, Shanxi Datong University, Datong 037009)

Using clearing DPPH free radicals in vitro, this experiment mainly determine antioxidant activity of 5 endophytic fungi from Eucommia ulmoides. The result showed that the endophytic fungi have a dose-dependent manner and their ability of clearing DPPH radicals has a growing trend with the increase of sample concentration. When the concentration is 0.5 g/mL, there are 1 strain which DPPH radical scavenging are more than 95 %. According to their morphology, cultural characteristics and ITS sequences, the strain EL05 was indentified as Aspergillus sp.

eucommia ulmoides;endophytic fungi;antioxidant activity;photographic photography;ITS sequences

2017-08-11

劉 洋(1995— )，在讀大學生；通訊作者：張弘弛(1980—)，博士，副教授，主要從事應用微生物的研究。

Q939.9

A

1008-021X(2017)20-0080-02