玉米漿對大腸桿菌JH-B22發酵產L-丙氨酸的影響

劉 棗，付相敏，潘海亮，王金華，王永澤*

(1.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068)

玉米漿對大腸桿菌JH-B22發酵產L-丙氨酸的影響

劉 棗1，2，付相敏1，2，潘海亮1，2，王金華1，2，王永澤1，2*

(1.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068)

為了進一步降低L-丙氨酸的生產成本，以大腸桿菌JH-B22為發酵菌株，以玉米漿為氮源、葡萄糖結晶廢糖液為碳源進行L-丙氨酸的發酵。結果表明，發酵培養基中玉米漿添加量為20 g·L-1較為適宜。在玉米漿發酵培養基中進行L-丙氨酸的發酵，L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為54.30 g·L-1和90.5%；其L-丙氨酸產量略低于無機鹽發酵培養基的 56.12 g·L-1和LB發酵培養基的56.48 g·L-1，但玉米漿發酵培養基具有配制更簡單、無需額外添加無機鹽或者成本較高的酵母粉等優點，可作為L-丙氨酸發酵生產的不錯選擇。

玉米漿；大腸桿菌；L-丙氨酸

L-丙氨酸在食品和醫藥領域有著十分重要的應用價值。在食品領域，L-丙氨酸和谷氨酸鈉制成混合調味品，在保證食物原有風格的條件下不改變食品的風味，L-丙氨酸還是甜味劑阿力甜的合成前體。在醫藥領域，L-丙氨酸不但可作為補糖氨基酸直接用作營養液，更是維生素B5、B6和L-氨基丙醇(氧氟沙星)的合成前體，還可用于制造抗癌藥4-羥基水楊醛丙氨酸合鋅[1-3]。

L-丙氨酸工業生產方法一般采用蛋白水解提取法、酶法和微生物發酵法[4]。微生物發酵法以其生產成本低、產品純度高、對環境污染小等優點受到了人們的普遍關注。工業上生產L-丙氨酸是借助德阿昆合假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)的菌懸液，以 L-天冬氨酸為底物脫羧生產， L-天冬氨酸由富馬酸經天冬氨酸酶催化合成，該工藝成本較高且有由二氧化碳排放引起的碳流失[5]。而通過富馬酸采用大腸桿菌工程菌直接生產L-丙氨酸，具有成本低的優勢[1-2]，但有研究者認為富馬酸是經石油煉制生產，反應底物屬于不可再生資源[6]。因此如何降低微生物發酵法合成L-丙氨酸的成本且保障原料來源的可再生性是目前相關研究的熱點。

借助基因工程的技術和手段，目前已有多個工程菌能直接利用各種易得碳源和氮源合成L-丙氨酸[6-8]。如能換用廉價的氮源或碳源進行L-丙氨酸發酵，無疑對降低L-丙氨酸的生物合成成本有著積極的促進作用。已有報道經基因改造的大腸桿菌可利用甘油作為碳源發酵產L-丙氨酸[6]。

為了進一步降低L-丙氨酸的生產成本，擬從培養基入手降低發酵成本。玉米漿為玉米制淀粉過程中的副產物，含有豐富的可溶性蛋白、無機鹽和可溶性糖，可作為微生物發酵的廉價氮源,還能減少培養基中無機鹽的添加，從而降低生產成本[9-10]，廣泛應用于微生物發酵生產中[11]。前期作者所在課題組利用玉米漿為主的發酵培養基培養大腸桿菌工程菌生產L-乳酸，取得了不錯的發酵效果[12]。因此，作者采用大腸桿菌JH-B22作為發酵菌株，以玉米漿為氮源、葡萄糖結晶廢糖液為碳源，取代葡萄糖和酵母粉為主的培養基生產L-丙氨酸，考察了發酵效果，擬為降低L-丙氨酸發酵成本提供參考。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

大腸桿菌JH-B22(ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔldhA ΔpflB::alaD)，出發菌為大腸桿菌EscherichiacoliW (ATCC 9637)，經基因工程手段構建而成，于甘油管-20 ℃保存。

平板培養基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20，瓊脂 20。

搖瓶種子培養基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20。

無機鹽發酵培養基(g·L-1)：七水硫酸鎂 0.5，一水硫酸錳 0.05，磷酸二氫鉀 1.5，磷酸氫二鉀 3.6，氯化鈉5，酵母粉 2，葡萄糖 60。

玉米漿發酵培養基(g·L-1)：玉米漿 20，葡萄糖(來自葡萄糖結晶廢糖液)60。

LB發酵培養基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 5，葡萄糖 20。

玉米漿(含氮1%)、葡萄糖結晶廢糖液，山東濰坊盛泰藥業有限公司。其它試劑均為市售分析純。

E2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；5804R型離心機，德國Eppendorf公司；SBA-40D型生物傳感儀，山東科學院生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子培養

菌種活化：用滅菌后的竹簽從甘油管中蘸取菌液，劃線至平板培養基中，置于恒溫培養箱37 ℃培養24 h。連續活化2～3代。

種子培養：從活化好的平板培養基上挑取少量菌落，接入400 mL搖瓶種子培養基中，搖床37 ℃培養12 h。

1.2.2 玉米漿添加量對發酵產L-丙氨酸的影響

用不同濃度(10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1)玉米漿和葡萄糖結晶廢糖液(葡萄糖濃度60 g·L-1)，配制成培養基后滅菌,即得玉米漿發酵培養基。將搖瓶種子液(OD600為1.0～1.5)按10%接種量接種至裝有4 L不同發酵培養基的7 L發酵罐(Sartorius Stedim，Biotech Gmb H 37070)中。發酵條件設定為：溫度37 ℃，轉速150 r·min-1，通氣量1 vvm，流加2 mol·L-1氫氧化鈉作為發酵中和劑控制發酵液pH值為6.0。每4 h取樣，檢測L-丙氨酸產量和葡萄糖含量，每批次發酵重復不少于3次。

1.2.3 玉米漿發酵培養基和其它發酵培養基發酵產L-丙氨酸的比較

將搖瓶種子液按10%接種量分別接種至裝有4 L無機鹽發酵培養基、玉米漿發酵培養基和LB發酵培養基的7 L發酵罐中，初始葡萄糖濃度均為60 g·L-1。發酵條件同1.2.2。每4 h取樣，檢測L-丙氨酸產量和葡萄糖含量，每批次發酵重復不少于3次。

1.2.4 檢測方法

(1)葡萄糖含量的測定

取適量樣品于10 000 r·min-1離心5 min，取上清液稀釋100倍，利用生物傳感儀測定葡萄糖含量。

(2)L-丙氨酸產量的測定

采用高效液相色譜儀測定。色譜條件：依力特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相為甲醇-磷酸氫二鈉混合液(pH值為6.5的0.05 mol·L-1磷酸氫二鈉與甲醇體積比1∶9)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣體積5 μL，檢測波長215 nm。

(3)甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸產量的檢測

采用高效液相色譜儀測定。色譜條件：有機酸柱AminexR HPX-87H ion exclusion column(300 mm×7.8 mm)，流動相為4 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣體積5 μL，檢測波長210 nm。

2 結果與討論

2.1 玉米漿添加量對發酵產L-丙氨酸的影響(圖1)

圖1 玉米漿添加量對發酵產L-丙氨酸的影響Fig.1 Effect of corn steep liquor dosage on L-alanineproduction by fermentation

從微生物培養的角度來看，玉米漿添加量不但影響整個培養基的碳氮比、比耗糖速率[13]，還會調整維生素和金屬離子含量來影響發酵[12]。從圖1可以看出，添加一定量的玉米漿作為氮源能提高L-丙氨酸的產量，不添加玉米漿時也有少量L-丙氨酸生成(小于3 g·L-1)，可能是由于種子液中殘余少量氮源至發酵液中。當玉米漿添加量為20 g·L-1時，L-丙氨酸產量最高，達到54.23 g·L-1。玉米漿添加量超過20 g·L-1時，L-丙氨酸產量提高并不明顯?？赡苁怯捎冢环矫妫衩诐{添加過量，許多金屬離子濃度過高，影響大腸桿菌的生長及發酵；另一方面，氮源過量容易導致菌體提前衰老自溶，影響產量的提高。綜合考慮，玉米漿添加量為20 g·L-1較為適宜。

2.2 玉米漿發酵培養基和其它發酵培養基發酵產L-丙氨酸的比較

為了進一步評估玉米漿發酵培養基的發酵能力，選用2種大腸桿菌發酵常見的無機鹽發酵培養基和LB發酵培養基作為對照進行比較，結果見圖2及表1。

圖2 3種發酵培養基發酵產L-丙氨酸的比較Fig.2 Comparison of L-alanine produced by threefermentation mediums

表13種發酵培養基對發酵產L-丙氨酸的影響

Tab.1Effect of three fermentation mediums on L-alanine production

從圖2可以看出，對于3種培養基，0～8 h時L-丙氨酸積累都很少，但8 h后，3種培養基的L-丙氨酸產量出現分化。發酵進行到20 h時，采用LB發酵培養基時，產量已達到最高，殘余葡萄糖含量基本趨于零；而采用玉米漿發酵培養基和無機鹽發酵培養基時，發酵稍微緩慢，在36 h時發酵才結束。

由表1進一步可知，在LB發酵培養基中L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為56.48 g·L-1和94.1%，且發酵在20 h就基本結束，其它2種發酵培養基發酵36 h后才結束；在玉米漿發酵培養基中L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為54.30 g·L-1和90.5%；在無機鹽發酵培養基中L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為56.12 g·L-1和93.5%。所有發酵培養基的副產物如琥珀酸和乙酸產量相差不大，但玉米漿發酵培養基中乳酸產量略高。

方差分析表明，玉米漿發酵培養基在發酵產L-丙氨酸上，與無機鹽發酵培養基和LB發酵培養基差異并不顯著(Plt;0.05)。玉米漿發酵培養基發酵產L-丙氨酸相對于其它2種發酵培養基，無論是發酵產量和發酵時間均不占優勢，與其它2種發酵培養基的組分相比，可能在蛋白的可利用性上存在一些差異。LB發酵培養基中蛋白胨是蛋白經過水解消化的產物；而無機鹽發酵培養基中添加的少量酵母粉無疑在L-丙氨酸發酵上扮演了重要角色，不少研究也證明酵母粉作為氮源在產量提高上更有優勢[14]。當然玉米漿經過蛋白酶處理，會增加其發酵上的效能[15]，但這樣無疑又增加了工序和成本。

玉米漿發酵培養基發酵生產L-丙氨酸仍然具有一定優勢：首先，玉米漿作為一種混合氮源，在和糖類一起高壓滅菌后，仍有不錯的發酵產量。有文獻[16]認為濾菌的方式更能保存玉米漿的營養成分，但從生產實踐來說，操作難度更大，本實驗對玉米漿和碳源采用混合滅菌的方式，工藝相對簡單。其次，相對其它2種發酵培養基，沒有添加任何額外的無機鹽，表明玉米漿發酵培養基中原有的無機鹽組分能基本滿足發酵的需求。最后，完全不使用酵母粉進行L-丙氨酸的發酵生產，對于降低L-丙氨酸的發酵成本無疑有較大的幫助。

3 結論

為了進一步降低L-丙氨酸的生產成本，以大腸桿菌JH-B22為發酵菌株，從培養基入手降低發酵成本，分別選用玉米生產淀粉副產物玉米漿和葡萄糖結晶廢糖液為氮源和碳源，發酵生產L-丙氨酸，并與2種大腸桿菌發酵常見的培養基——LB發酵培養基和無機鹽發酵培養基發酵產L-丙氨酸進行對比。結果表明：(1)玉米漿最佳添加量為20 g·L-1，配以葡萄糖結晶廢糖液60 g·L-1，能在36 h結束發酵，L-丙氨酸產量可達54.30 g·L-1，糖酸轉化率為90.5%。(2)3種培養基中，LB發酵培養基發酵產L-丙氨酸效果最好，L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為56.48 g·L-1和94.1%，且發酵在20 h基本結束。無機鹽發酵培養基發酵產L-丙氨酸產量和糖酸轉化率分別為56.12 g·L-1和93.5%，發酵在36 h基本結束。(3)相比無機鹽發酵培養基和LB發酵培養基，玉米漿發酵培養基產L-丙氨酸產量只有微小差別，但仍然能在36 h內完成發酵，且玉米漿培養基可直接和碳源一起滅菌，無需添加任何酵母粉和額外的無機鹽，在成本上也具有一定優勢。因此玉米漿發酵培養基可作為L-丙氨酸發酵的不錯選擇。

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EffectofCornSteepLiquoronL-AlanineFermentationbyEscherichiacoliJH-B22

LIU Zao1，2，FU Xiang-min1，2,PAN Hai-liang1，2，WANG Jin-hua1，2，WANG Yong-ze1，2*

(1.KeyLaboratoryofFermentationEngineeringofMinistryofEducation，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430068，China;2.HubeiCooperativeInnovationCenterforIndustrialFermentation，Wuhan430068，China)

In order to reduce the production cost of L-alanine,we usedEscherichiacoliJH-B22 as a fermentation strain,corn steep liquor as a nitrogen resource,and waste sugar liquid of glucose crystallization as a carbon resource to produce L-alanine by fermentation.Results showed that it was suitable to add 20 g·L-1corn steep liquor in fermentation medium.When using corn steep liquor fermentation medium，L-alanine yield and sugar-acid conversion rate would reach 54.30 g·L-1and 90.5%，respectively.Although L-alanine yield of corn steep liquor fermentation medium was less than that of mineral salts fermentation medium(56.12 g·L-1) and LB fermentation medium(56.48 g·L-1),corn steep liquor fermentation medium could be a good choice for L-alanine production because of easy preparation and unnecessary additional mineral salts or high cost yeast powder.

corn steep liquor；Escherichiacoli；L-alanine

湖北省自然科學基金項目(2011CDB076),湖北省教育廳科研基金項目(B20121402)

2017-06-27

劉棗(1980-)，女，湖北武漢人，實驗師，研究方向：發酵及檢測技術，E-mail：24825848@qq.com；通訊作者：王永澤，博士，副教授，E-mail:wyzzju@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.003

劉棗，付相敏，潘海亮，等.玉米漿對大腸桿菌JH-B22發酵產L-丙氨酸的影響[J].化學與生物工程，2017，34(11)：11-14.

TQ922.2 Q815

A

1672-5425(2017)11-0011-04