三維熒光光譜法和圓二色譜法研究氨基比林與牛血清白蛋白分子的相互作用

王曉霞，李松波，馬力通，郭貴寶，劉金彥，王正德，閆 慧

（內蒙古科技大學化學與化工學院，內蒙古 包頭 014010）

三維熒光光譜法和圓二色譜法研究氨基比林與牛血清白蛋白分子的相互作用

王曉霞，李松波，馬力通，郭貴寶，劉金彥，王正德，閆 慧

（內蒙古科技大學化學與化工學院，內蒙古 包頭 014010）

該文在模擬生理條件下，采用熒光光譜法、三維熒光光譜法以及圓二色譜法，研究氨基比林（PYM）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用。研究結果表明PYM對BSA有強烈的熒光猝滅作用，其熒光猝滅機制為靜態猝滅。由熱力學參數判定PYM和BSA的主要作用力為氫鍵和范德華力，并且相互作用是自發進行的。根據F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉移理論可以得出PYM與BSA之間的結合距離為2.09nm。利用三維熒光光譜和圓二色譜技術，分析PYM對BSA蛋白構象的影響，表明PYM與BSA相互作用后使BSA的微環境和構象發生改變。

氨基比林；牛血清白蛋白；熒光猝滅；三維熒光光譜；圓二色譜

0 引 言

氨基比林又名匹拉米洞（Pyramidon），為解熱鎮痛藥，其鎮痛作用強而持久，對胃腸道刺激性小[1]。血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質，能與進入血液中的藥物進行可逆結合從而起到在體內轉運的作用。因為結構上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）被廣泛用于與藥物結合作用的研究[2]。BSA可運載不溶性藥物小分子，依靠的作用力有范德華力、靜電引力、氫鍵、疏水作用力等[3]。

血清白蛋白與各種藥物小分子的作用涉及很多領域與學科，關于這方面的研究一直沒有間斷過。Fang等[4]利用光譜研究白果酚與牛血清白蛋白之間的相互作用。張玉明等[5]利用熒光光譜研究桿菌肽與牛血清白蛋白相互作用。目前尚未見氨基比林與牛血清白蛋白間作用的熒光光譜法研究，本文主要在模擬生理狀況條件下，用熒光光譜法探討了氨基比林和牛血清蛋白結合的特征，確定了PYM與BSA作用力種類，分析PYM對BSA構象的影響，以期為氨基比林的應用和開發提供數據參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

熒光分光光度計（LS-55，美國PerkinElmer公司）；紫外分光光度計（SPECORD50，德國耶拿分析儀器股份公司）；數顯恒溫水浴振蕩器（SHA-B，金壇市醫療儀器廠）；圓二色光譜儀（Jasco-715，北京國嘉恒業科學儀器有限公司）；實驗室pH計（EL20，上海梅特勒-托利多公司）；電子天平（TP-114，北京丹佛儀器有限公司）。

無水乙醇（天津市光復科技有限發展公司）；HCl（北京化工廠，分析純）；NaCl（天津市光復科技發展有限公司，分析純）；氨基比林（Pyramidon，PYM，中國藥品生物制品檢定所，分析純）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，sigma 公司，分析純）；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，天津市華東試劑廠，分析純）；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。

1.2 溶液配制

0.1 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液（pH 7.40）：稱取3.028 5 g三（羥甲基）氨基甲烷，用二次去離子水溶解，配制250 mL Tris溶液備用；將配好的Tris溶液取適量于500mL燒杯中，用鹽酸調節pH為7.40。

牛血清白蛋白溶液：準確稱取0.6700g BSA用二次去離子水溶解，配置成100mL 1×10-4mol/L的BSA儲備溶液備用；取1×10-4mol/L BSA 5 mL于100mL容量瓶中，加入20mL 0.5mol/L的NaCl，用pH為7.40的Tris-HCl緩沖液定容，即可得到5×10-6mol/L的BSA溶液。

1×10-4mol/L氨基比林溶液：準確稱取0.0023g氨基比林，二次去離子水溶解，配制成1×10-4mol/L的氨基比林溶液備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 PYM與BSA的熒光光譜、同步光譜測定

向10mL具塞比色管分別加入1mL 5×10-6mol/L的BSA 溶液，然后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL 1×10-4mol/L PYM 溶液，二次去離子水定容，搖勻。分別在（299±0.1）K，（307±0.1）K，（315±0.1）K的恒溫水浴鍋中放置0.5 h，作為待測溶液。固定熒光激發波長280 nm，激發與發射狹縫9nm，掃描速度 1500nm/min，掃描290～550nm的發射光譜，每次記錄發射波長在345nm附近的熒光強度。在同步熒光光譜掃描中，掃描發射波長范圍為250～550nm的發射光譜，掃描速度1500nm/min，記錄Δλ=60nm和Δλ=15nm的熒光強度。

1.3.2 BSA、PYM-BSA的三維熒光光譜的測定

使用熒光儀測定溶液的三維熒光光譜。其參數設置為：發射波長200～500nm，激發波長200nm，狹縫寬度 9 nm，掃描速度 1 500 nm/min，組分數30，激發波長間隔5nm。

1.3.3 PYM與BSA圓二色譜測定

測量時 BSA 與 PYM 的濃度比為 1∶0，1∶1，1∶5，并且以Tris-HCL緩沖液作為參比，所有數據經過4次掃描取平均值，溶液中BSA樣品濃度為1.0×10-5mol/L，PYM 濃度為 1.0×10-5，5.0×10-5mol/L。掃描范圍為190～250nm，掃描時間為0.5s，石英樣品池的光程為0.1cm，掃描速度為3.3nm/s，靈敏度為2mdeg/cm，分辨率為0.1nm，光譜校正設為開啟以消除光柵和檢測器相應的波長。

2 分析結果與討論

2.1 PYM與BSA相互作用的熒光光譜分析

測定 299，307，315 K 3個溫度下 BSA與 PYM的熒光光譜圖，如圖1所示，固定熒光激發波長為280 nm，BSA的最大發射熒光強度會出現在345 nm處，并且在BSA濃度不變的情況下，隨著PYM的不斷加入，BSA在345 nm附近的熒光強度明顯減弱，但最大熒光強度發射波長位置基本不變，表明PYM對BSA有熒光猝滅作用。

2.2 PYM與BSA猝滅作用機理的確定

PYM與BSA的相互作用屬于熒光猝滅，而已知的熒光猝滅分為靜態猝滅與動態猝滅兩種，均符合Stern-Volmer公式[6]：

圖1 不同溫度下PYM與BSA相互作用的熒光光譜圖

圖2 不同溫度下PYM對BSA的熒光猝滅Stern-Volmer曲線圖

式中：F0、F——未加入和加入PYM的BSA的熒光強度；

[Q]——PYM的摩爾濃度，mol/L；

KSV——動態猝滅常數，L/mol；

Kq——由擴散過程控制的雙分子動態猝滅速率常數，L/（mol·s）；

τ0——沒有PYM存在的情況下熒光分子平均壽命，通常τ0約為 10-8s[7]。

當溫度不斷升高，動態猝滅常數會變大，但靜態猝滅常數會變小，可依據計算結果辨別出此反應的熒光猝滅種類。

根據 Stern-Volmer公式，以 F0/F對[Q]作圖，得到 299，307，315K 下的 Stern-Volmer曲線圖，如圖 2所示，線性方程與相關系數如表1所示。

表1 Stern-Volmer線性方程相關系數

一般來說，由于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數為 2.0×1010L/（mol·s）[8]，由表 1可以看出，PYM對BSA的動態熒光猝滅速率常數Kq遠大于最大擴散碰撞猝滅常數，證明PYM對BSA的作用是靜態猝滅；并且隨著溫度升高，曲線斜率降低，而曲線斜率代表猝滅常數KSV，即猝滅常數KSV隨著溫度的升高而降低，進一步證明了PYM對BSA的作用是靜態猝滅。

2.3 PYM與BSA結合常數及結合位點數的確定

當小分子與大分子相互結合時結合位點數n和結合常數K[9]，可以由下式得出：

式中：K——PYM與BSA的結合常數，L/mol；

n——PYM與BSA的結合位點數。

分別做不同溫度下的 lg[（F0-F）/F]-lg[Q]的關系圖，根據式（2）得出不同狀態下的K和n，見表2。

表2 PYM對BSA反應的結合常數K與結合位點數n

由表中可以看出PYM與BSA的結合常數都很大，而且由計算得出的結合位點數都接近1，由此可知PYM與BSA的結合很緊密，但是隨著溫度的升高，結合位點數與結合常數不斷減小，也進一步佐證PYM與BSA的作用屬于靜態猝滅，與猝滅常數KSV的結論相吻合。

2.4 PYM和BSA結合作用的熱力學參數以及作用力的判定

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。當溫度改變不大時，反應的焓變ΔrHm相當于一個常數[10]。根據文獻[11]，當 ΔH＞0，ΔS＞0時， 反應主要為疏水作用力； 當 ΔS＜0，ΔH＜0時，作用力為氫鍵和范德華力；當 ΔH＜0，ΔS＞0 時，作用力為靜電引力。由熱力學公式：

式中：T——熱力學溫度，K；

K——PYM與BSA的結合常數，L/mol；

ΔrGm——吉布斯自由能，J/mol；

ΔrHm——反應焓變，J/mol；

ΔrSm——反應熵變，J/（mol·K）。

分別計算得出299，307，315K下PYM與BSA作用的自由能變ΔrGm、ΔrHm和ΔrSm結果如表3所示。

表3 PYM與BSA熱力學參數

由表可以看出，PYM與BSA的熱力學參數ΔrHm＜0和 ΔrSm＜0， 可以推斷出PYM與BSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力。而ΔrGm＜0，所以PYM與BSA的相互作用是自發進行的。

圖3 PYM的紫外吸收光譜與BSA的熒光光譜

2.5 PYM與BSA的結合距離

F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉移理論指出：當供能體物質發射熒光，供能體的熒光發射光譜與受能體的紫外吸收光譜有重疊，供能體與受能體足夠靠近，最大距離不超過7 nm時，會發生非輻射能量轉移現象，導致熒光物質的熒光強度猝滅[12]。實驗測出PYM的紫外可見吸收光譜與BSA的熒光發射光譜，發現兩光譜之間有一定的重疊，如圖3所示。

根據以下公式計算出PYM與BSA的結合距離：

式中R0是臨界距離（能量轉移效率為50%時）；r為供體-受體間的結合距離；K2為偶極空間取向因子（可取受能體和供能體各向隨機分布的平均值，即2/3）；N為介質折射指數（一般取水和有機物折射指數的平均值，即1.336）；φ為供能體熒光量子產率（通常取蛋白質中色氨酸的量子產率，即0.118）；J為供體（蛋白）熒光發射光譜與受體（藥物）吸收光譜間的光譜重疊部分；F（λ）為供能體在波長λ處的熒光強度；ε（λ）為受能體在波長λ時的紫外摩爾吸收系數；F 為 CBSA∶CPYM=1∶1 時 BSA 的熒光強度。

由式（8）采用矩形分割法能夠求出圖中PYM與BSA兩光譜陰影部分面積積分值 J=9.18×10-15L/（mol·cm3），由 K2=2/3、N=1.336、φ=0.118 并利用式（7）可計算出臨界距離R0=2.235 nm，根據式（6）求得能量轉移效率E=0.6580，進而由R0和E求出供體-受體間的結合距離r=2.09nm。本實驗計算求得PYM與BSA中色氨酸殘基（Trp）之間的距離明顯小于7 nm，表明PYM與BSA之間能發生非輻射能量轉移。

圖4 PYM-BSA的同步熒光光譜圖

2.6 PYM與BSA的同步熒光光譜圖

當Δλ=15nm時同步熒光光譜僅僅表示酪氨酸殘基的熒光信息，當Δλ=60nm時同步熒光光譜只表示色氨酸殘基的熒光信息。因為蛋白質中氨基酸殘基的最大發射波長與它所存在環境的極性和疏水性有關，所以由發射波長的變化可判斷蛋白質構象變化，若體系的極性增大，則會發生紅移，疏水性增大則會發生藍移[13]，圖 4為 Δλ=15nm，Δλ=60nm 的熒光光譜圖。

由圖可知Δλ=60nm時，隨著PYM濃度的逐漸變大，PYM-BSA體系的最大發射波長出現紅移，表明色氨酸殘基存在的環境極性變強。當Δλ=15nm時PYM 對 BSA 的猝滅作用較弱（KSV=2.68×104L/mol），而 Δλ=60nm 時的猝滅作用較強（KSV=3.16×104L/mol），色氨酸殘基對BSA熒光猝滅的貢獻高于酪氨酸殘基，由此可判斷PYM主要結合在BSA中的色氨酸殘基上。

2.7 三維熒光光譜圖

為進一步考查樣品的分布情況和構型變化，測得三維熒光光譜圖，如圖5、圖6所示。

由圖5、圖6可以看出三維熒光光譜圖主要有兩種峰，一種是“山脊”狀的瑞麗散射峰如峰a和峰b，另一種是類似“駝峰”的典型熒光峰如峰1和峰2。從圖中可以看出加入PYM溶液后，熒光峰1和2的強度有所降低，單獨BSA的峰1相對應的峰頂坐標和熒光強度（λex/λem，F）為（280/334，184.95），峰 2相對應的峰頂坐標和熒光強度（λex/λem，F）為（225/336，423.36）；當加入PYM之后峰1相對應的峰頂坐標和熒光強度（λex/λem，F）為（280/338，151.19），峰 2 相對應的峰頂坐標和熒光強度（λex/λem，F）為（225/340，346.83）。從數據中可以明顯的看出熒光峰的強度降低。峰1，峰2的發射波長均紅移了4 nm。這表明PYM與BSA相互作用之后使得體系所處的微環境的極性增強，由此說明加入PYM之后BSA的構象發生了改變。

圖5 1×10-7mol/L BSA溶液的三維熒光光譜及等高線圖

圖6 PYM+BSA溶液的三維熒光光譜及等高線圖

表4 三維激發發射熒光光譜特征參數

圖7 BSA與PYM相互作用的CD譜圖

2.8 PYM與BSA的圓二色譜分析

為了進一步研究PYM對BSA構象的影響，運用圓二色譜進行分析，PYM與BSA相互作用的結果如圖7所示。從圖9的結果可知：BSA分子的CD譜分別在208nm和222nm處具有雙負峰形，這是典型的α-螺旋結構，隨著PYM加入到BSA中的比例增大，BSA分子在208 nm和222 nm這兩處的負峰所表示的摩爾橢圓率顯著降低，但是光譜的峰位置并沒有改變，CD的測量結果用平均摩爾橢圓率（mean residue ellipticity，MRE）表示，單位是 deg·cm2/dmol，α-螺旋結構的含量用下列方程根據在208 nm處的MRE 值（MRE208）[14]計算，公式如下：

式中：θ——CD譜測得的摩爾橢圓率，mdeg；

N——BSA中氨基酸殘基個數，583；

L——所用樣品池的光程，1mm；

C——蛋白質的摩爾濃度，mol/L；

MRE208——208nm的平均摩爾橢圓率；

4000——β－折疊和無規卷曲構象跨過208nm的MRE；

33000——純α-螺旋在208nm的MRE。

由式（9）與式（10）計算結果知，在游離態的BSA中，α-Helix含量為52.32%，當BSA與PYM的濃度比為 1∶1 時，α-Helix含量為 45.22%，濃度比為 1∶5 時，α-Helix含量為 40.12%，在加入 PYM后 BSA的α-Helix含量均發生了降低。PYM與BSA之間結合主要是多肽鏈的氨基酸殘基相結合，結果說明PYM與BSA的結合破壞了原有的蛋白質的氫鍵結構，導致疏水性降低，肽鏈伸展，使α-螺旋結構含量降低。說明BSA在運輸PYM時不僅改變了氨基酸的微環境，還使BSA的二級結構發生了改變。

3 結束語

實驗表明：氨基比林對BSA的猝滅作用是靜態猝滅， 由熱力學公式得出的 ΔrHm＜0；ΔrSm＜0；ΔrGm＜0說明PYM與BSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力，而且是一個自發的過程。由同步熒光光譜圖以及三位熒光光譜圖可知，PYM對BSA的結合位點更接近于色氨酸殘基，而且隨著PYM的加入引起BSA中酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的環境極性增強，表明BSA的構象發生改變。通過PYM與BSA圓二色譜分析得出在加入PYM后BSA的α-Helix含量均發生了降低，PYM與BSA之間結合主要是多肽鏈的氨基酸殘基相結合，結果說明PYM與BSA的結合破壞了原有的蛋白質的氫鍵結構。這些探索能夠幫助了解PYM的作用機理，PYM的毒副作用，為PYM的進一步探索做了鋪墊。

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（編輯：莫婕）

Study on the interaction between aminopyrine and bovine serum albumin by three-dimensional fluorescence spectrometry and circular dichroism spectrum

WANG Xiaoxia， LI Songbo， MA Litong， GUO Guibao， LIU Jinyan， WANG Zhengde， YAN Hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China）

The interaction between aminopyrine （PYM） and bovine serum albumin （BSA）were investigated with fluorescence spectroscopy， three-dimensional fluorescence spectroscopy， circular dichroism （CD） spectrum and under imitated physiological conditions.The results show that PYM could strongly quenching the fluorescence of BSA and the quenching process is a static process.The thermoclynamic parameters demonstrated that PYM can spontaneously bind with BSA through hydrogen bonds and Van der Waals forces.The binding distance of 2.09 nm between PYM and BSA was obtained by the F?rster’s theory on resonance energy transfer.Three-dimensional fluorescence spectroscopy and circular dichroism （CD） spectrum show that PYM could change the miro-enviroment and conformation of BSA.

aminopyrine； bovine serum albumin； fluorescence quenching； three-dimensional fluorescence spectroscopy；circular dichroism spectrum

A

1674-5124（2017）09-0074-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.09.014

2017-01-10；

2017-03-23

國家自然科學基金（21463016）；內蒙古自然科學基金（2013MS0209）；內蒙古高等學校科學研究項目（NJZZ14160）

王曉霞（1984-），女，內蒙古包頭市人，講師，碩士，研究方向為熒光光譜分析。