七種野生鐵線蓮屬植物核型分析

王娜，王奎玲，劉慶華，劉慶超

(青島農業大學園林與林學院，山東 青島 266109)

七種野生鐵線蓮屬植物核型分析

王娜，王奎玲，劉慶華，劉慶超*

(青島農業大學園林與林學院，山東 青島 266109)

鐵線蓮屬植物種間在形態、香味、花量、綠期及生活型等方面差異較大，遺傳背景也相對復雜，因此在雜交育種前了解其核型特征意義重大。采用染色體常規壓片法，對東方鐵線蓮、大花鐵線蓮、大葉鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、棉團鐵線蓮、齒葉鐵線蓮和東北鐵線蓮7種野生鐵線蓮屬植物的倍性及核型進行分析，結果表明，1) 7種野生鐵線蓮中除東北鐵線蓮為四倍體(2n=4x=32)外，另外6種均為二倍體(2n=2x=16)，染色體基數為8。染色體類型有中部(m)、亞中部(sm)、亞端部(st)、端部(t)4種，其中大花鐵線蓮和大葉鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m+2st+t，褐毛鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m+3st，棉團鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m+2st(SAT)+t，齒葉鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m(SAT)+2st+t，東方鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m(SAT)+sm(SAT)+2st，東北鐵線蓮的核型公式為2n=4x=32=5m+2st+t。東方鐵線蓮、棉團鐵線蓮、齒葉鐵線蓮的短臂上帶有隨體。2) 核型不對稱系數為62.27%～66.77%，核型類型均為2A型，表明7種野生鐵線蓮屬植物的進化程度均較原始。其中，褐毛鐵線蓮和齒葉鐵線蓮為首次報道。

鐵線蓮屬；染色體；核型分析

物種的核型反映了其染色體水平的整體特征，研究物種的核型有助于判斷物種間的親緣關系，揭示其遺傳進化的過程和機制[6]。國內已有學者對不同地區野生鐵線蓮的某些種及品種做過研究報道。龔維忠等[7]對東北及北京地區的11種鐵線蓮進行核型分析研究。張鐿鋰等[8-9]先后對國內13種鐵線蓮進行核型分析，并探討了某些種的親緣關系及其分類。楊親二等[10]對粗齒鐵線蓮(Clematisargentilucida)和揚子鐵線蓮(Clematisganpiniana)進行過核型報道。彭綠春等[11]對金毛鐵線蓮(Clematischrysocoma)等4種野生鐵線蓮屬植物的核型進行了詳細報道。盛璐[12-13]陸續對鐵線蓮屬23個種進行了染色體核型分析，并對其進行分類。此外，Sheidai等[14]對銀葉鐵線蓮(Clematisdelavayi)等3種野生鐵線蓮屬植物進行核型分析及分類，發現不同地區的同種鐵線蓮核型有所不同。同時，段青等[15]也曾提到同一物種不同居群在形態和分子方面有較高的遺傳多樣性，居群間的遺傳分化較大。相較于中國各地區豐富的野生鐵線蓮屬植物資源，僅這些居群的染色體資料還不夠，且對于有些種類如大花鐵線蓮(Clematispatens)[7,13]、東北鐵線蓮(Clematisternifloravar.mandshurica)等[8]前人的研究結果也不盡相同。

遠緣雜交在高等植物的進化過程中起著重要的作用[16]。如今鐵線蓮屬植物在園林綠化應用方面的推廣價值很高，野生種或品種雖在適應性等其他特性上占有優勢，但這種優勢往往不能集中。因此，通過遠緣雜交等途徑集合鐵線蓮屬中各種的優良特性，培育出花量覆蓋率大、單花大、花香、綠期長的新品種，并利用雄蕊瓣化的特性改良單瓣花以得到具有優質觀賞價值的重瓣花。但為避免前人研究的不確定性對今后的實驗帶來困擾，為積累鐵線蓮屬植物在染色體層面的基本特征狀況，本研究選擇7種在北方適應性較強又均存在各自優良品質的鐵線蓮屬植物，如花香濃郁的東北鐵線蓮、大花型的大花鐵線蓮、鐘狀花型的褐毛鐵線蓮(Clematisfusca)、花量覆蓋率大的齒葉鐵線蓮(Clematisserratifolia)、半灌木型的大葉鐵線蓮(Clematisheracleifolia)以及雄蕊瓣化較多的棉團鐵線蓮(Clematishexapetala)等作為種質資源創新的材料，并對其染色體核型進行分析，為后續的雜交育種提供可靠的細胞學依據，同時也為其遺傳變異、系統分類、品種特性以及栽培利用等方面奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

7種野生鐵線蓮屬植物材料(表1)自野外采集后，于2014年12月統一栽植于青島農業大學試驗地內。除東方鐵線蓮(Clematisorientalis)是以種子萌發的幼嫩根尖為材料外，其他皆于2016年4月取盆栽植株新長出的幼嫩側根的根尖為材料。

1.2試驗方法

采用染色體常規壓片法[17]，于早10:00-11:00切取新長出長度為1～2 cm的根尖，蒸餾水清洗后，在4 ℃條件下以0.1%的秋水仙素溶液處理4 h，再經蒸餾水清洗后用卡諾固定液4 ℃冰箱中固定20 h，之后以95%、85%各20 min的乙醇梯度浸泡后轉70%的乙醇中置于4 ℃的冰箱內保存備用。染色體制片時，經酸解(1 mol/L HCl，60 ℃水浴10 min)和酶解(2.5%混合酶，4 ℃下1 h)兩次解離，用蒸餾水清洗干凈，取根尖頂端2 mm的乳白色分生區于載玻片上，并用濾紙在一側吸干水分，滴改良卡寶品紅溶液染色10 min，蓋上蓋玻片，輕敲，壓片，在Oympus顯微鏡下鏡檢，拍照。

表1 供試材料Table 1 Materials used for this study

1.3數據分析

從7種野生鐵線蓮染色體制片中分別選出30個較好的分裂相，觀察并統計其染色體的數目。并從中選5個清晰且分散最好的分裂相，以Photoshop CS3摳圖對比配對，Image J測其染色體的臂長，以這5個細胞各項指標的均值為各參數值計算。染色體核型分析采用李懋學等[18]的分類標準。核型對稱與不對稱分類參照Stebbins[19]的標準。著絲粒位置的確定參照Levan等[20]的二點四區系統標準。核型不對稱系數(asymmetric karyotype coefficient, AKC)按Arano[21]的方法計算。

核型不對稱系數(AKC)=(染色體長臂總長/全組染色體總長)×100%

2 結果與分析

7種鐵線蓮材料的染色體形態、數目及核型圖見圖1。核型分析的主要染色體參數列于表2和表3，并分述如下。

東方鐵線蓮(C.orientalis)：染色體數2n=2x=16，為二倍體。核型公式為2n=16=5m(SAT)+sm(SAT)+2st。染色體相對長度為10.34%～14.71%，臂比的變化范圍為1.17～6.07，平均臂比為2.31，最長與最短染色體的比值為1.42，核型不對稱系數為62.27%，著絲點指數為36.55%，其核型屬于“2A”型。第5、6對染色體的短臂上存在次縊痕，連有隨體。

大花鐵線蓮(C.patens)：染色體數2n=2x=16，為二倍體。核型公式為2n=16=5m+2st+t，染色體相對長度為9.38%～15.27%，臂比的變化范圍為1.34～8.50，平均臂比為3.22，最長與最短染色體的比值為1.63；核型不對稱系數為66.77%；著絲點指數為31.19%，其核型屬于“2A”型。

東北鐵線蓮(C.ternifloravar.mandshurica)：染色體數2n=4x=32，為四倍體。核型公式：2n=32=5m+2st+t，染色體的相對長度變化范圍為8.70%～15.93%，臂比的變化范圍為1.07～9.38，平均臂比為3.24，最長與最短染色體的比值為1.83，核型不對稱系數為63.99%，著絲點指數為33.04%，屬于“2A”型。

褐毛鐵線蓮(C.fusca)：染色體數2n=2x=16，為二倍體。核型公式為2n=2x=16=5m+3st，染色體相對長度為9.47%～14.88%，臂比的變化范圍為1.16～5.38，平均臂比為2.49，最長染色體與最短染色體的比值為1.57；核型不對稱系數為63.02%，著絲點指數為34.8%，屬于“2A”型。

大葉鐵線蓮(C.heracleifolia)：染色體數2n=2x=16，為二倍體。核型公式為2n=2x=16=5m+2st+t，染色體相對長度為8.37%～14.78%，臂比的變化范圍為1.17～11.67，平均臂比為3.32，最長染色體與最短染色體的比值為1.76，核型不對稱系數為64.77%，著絲點指數為33.14%，屬于“2A”型。

棉團鐵線蓮(C.hexapetala)：染色體數2n=2x=16，二倍體。核型公式為2n=2x=16=5m+2st(SAT)+t，染色體相對長度為9.98%～14.77%，臂比的變化范圍為1.10～7.64，平均臂比為2.87，最長染色體與最短染色體的比值為1.47；核型不對稱系數為64.49%，著絲點指數為33.77%，屬于“2A”型。第7對染色體的短臂上連有隨體。

圖1 7種鐵線蓮中期染色體形態及核型模式圖Fig.1 Somatic metaphase photomicrographs and idiogram of seven species of Clematis A：東方鐵線蓮C. orientalis；B：大花鐵線蓮C. patens；C：東北鐵線蓮C. terniflora var. mandshurica；D：褐毛鐵線蓮C. fusca；E：大葉鐵線蓮C. heracleifolia；F：棉團鐵線蓮C. hexapetala；G：齒葉鐵線蓮C. serratifolia.

齒葉鐵線蓮(C.serratifolia)：染色體數2n=2x=16，二倍體。核型公式為2n=2x=16=5m(SAT)+2st+t，染色體相對長度為9.14%～15.77%，臂比的變化范圍為1.24～11.75，平均臂比為3.51，最長染色體與最短染色體的比值為1.73，核型不對稱系數為65.41%，著絲點指數為32.3%，屬于“2A”型。第5對染色體的短臂上有隨體。

注：相對長度Relative length:長臂Long arm+短臂Short arm=全長Total.*：隨體，隨體長度不計入染色體長度；m：中部著絲粒染色體；sm：亞中部著絲粒染色體；st：亞端部著絲粒染色體；t：端部著絲粒染色體。下同。

Notes：* satellite, chromosome length exclude satellites. m: Metacentric chromosome；sm: Submetacentric chromosome；st: Subtelocentric chromosome；t: Telocentric chromosome. The same below.

表3 7種野生鐵線蓮主要核型特征比較Table 3 The comparison on significant characteristics of chromosome of seven species of Clematis

3 討論

本研究對7種野生鐵線蓮的核型進行了分析。首次報道了褐毛鐵線蓮和齒葉鐵線蓮的核型，均為2A型。其中褐毛鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m+3st，不含隨體，核型不對稱系數為63.02%；齒葉鐵線蓮的核型公式為2n=2x=16=5m(SAT)+2st+t，第5對染色體的短臂上有隨體，核型不對稱系數為65.41%。與Sheidai等[14]的研究相比較，本研究中東方鐵線蓮的核型公式及類型與其不一致，Sheidai等[14]研究的東方鐵線蓮取自Roodbar地區，核型為2B型。造成這種差異的原因可能是環境和地理因素的不同，周其興等[22]和尚寶龍等[23]對核型的研究中也提到B型染色體通常具有較強的適應力和競爭力，相較于A型不對稱性更強，進化程度更高。同時，從生境條件來看，伊朗北部Roodbar地區的東方鐵線蓮位于較高的海拔，具有較強的耐寒冷、抗紫外及其他抗逆能力，通常能夠在比較惡劣的環境中生存，這在一定程度上與該植物中存在B型染色體有關，同時也表明東方鐵線蓮的遺傳變異更為活躍。因此，中國新疆地區東方鐵線蓮的種植資源較為原始，而伊朗北部Roodbar地區的東方鐵線蓮為了適應環境而更為進化。

大花鐵線蓮和大葉鐵線蓮的核型公式與龔維忠等[7]的相悖，且未發現隨體，與盛璐[13]的核型公式相同，但由于是不同來源的種質，相同的核型類型下也有著不同的對稱性。李懋學等[17]認為在植物界，核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發展的，處于比較古老或原始的植物，大多具有較對稱的核型，而不對稱的核型則常見于衍生的或進化較高級的植物中[24]。核型不對稱系數可反映不同種質的不對稱性，取自南京的比取自遼寧的大葉鐵線蓮不對稱性更低，更為原始。平均臂比與染色體長度比也可從另一角度反映不同鐵線蓮的不對稱性，二者的值越大，核型不對稱性越高[24]，再綜合核型不對稱系數，可知取自遼寧的比取自山東的大花鐵線蓮不對稱性更高，更為進化。東北鐵線蓮是圓錐鐵線蓮的一個變種，為四倍體(2n=4x=32)，與龔維忠等[7]的研究結果相同。

研究發現東方鐵線蓮、棉團鐵線蓮和齒葉鐵線蓮帶有隨體，且均位于染色體短臂，這一結果符合李懋學等[18]研究中所提到的大部分植物的隨體位于短臂的結論，其他4種無隨體。但在其他學者的研究中大花和東北鐵線蓮也有隨體存在[7]。關于隨體，李真等[25]的研究中提到，由于不同居群的進化過程不同，導致其核型特征特別是隨體的數量、大小、分布位置往往存在差異。因此，無論是在核型公式、核型的對稱性，還是在有無隨體的研究上均能證明由于種源地的不同，其核型會存在細微差別。但這種差別是否會對遠緣雜交產生影響，有待于進一步的探討。

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KaryotypeanalysisofsevenwildClematisspecies

WANG Na, WANG Kui-Ling, LIU Qing-Hua, LIU Qing-Chao*

College of Landscape Architecture and Forestry, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China

There are many significant differences in the wild species ofClematis, including differences in morphology, aroma, flower number, green period and life form. These differences reflect the species’ complex genetic background. It is advantageous to study the chromosome karyotypes of the variousClematisspecies prior to any attempts at cross-breeding. In this study, traditional squashing methods were used to study the karyotypes of 7 wildClematisspecies:Clematisorientalis,C.patens,C.heracleifolia,C.fusca,C.hexapetala,C.serratifoliaandC.ternifloravar.mandshurica. The results showed that six of theClematisspecies were diploid (2n=2x=16), with the exception beingC.ternifloravar.mandshurica, which is tetraploid (2n=4x=32). The basic chromosome number was 8. The karyotypes of all the testedClematisspecies were mainly made of median, submedian, subterminal and terminal chromosomes. Their karyotype formulae are as followsC.patensandC.heracleifolia: 2n=2x=16=5m+2st+t;C.fusca: 2n=2x=16=5m+3st;C.hexapetala: 2n=2x=16=5m+2st(SAT)+t;C.serratifolia: 2n=2x=16=5m(SAT)+2st+t;C.orientalis: 2n=2x=16=5m(SAT)+sm(SAT)+2st;C.ternifloravar.mandshurica: 2n=4x=32=5m+2st+t. The karyotype formulae ofC.orientalis,C.hexapetalaandC.serratifoliahad satellites in the long arm of their chromosomes. The asymmetry index of the chromosomes ranged from 62.27% to 66.77%. The karyotypes of theseClematisspecies were 2A, showing that these seven species are relatively primitive. The karyotypes ofC.fuscaandC.serratifoliaare reported here for the first time.

Clematis; chromosome; karyotype analysis

10.11686/cyxb2017025http//cyxb.lzu.edu.cn

王娜, 王奎玲, 劉慶華, 劉慶超. 七種野生鐵線蓮屬植物核型分析. 草業學報, 2017, 26(11): 123-130.

WANG Na, WANG Kui-Ling, LIU Qing-Hua, LIU Qing-Chao. Karyotype analysis of seven wildClematisspecies. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 123-130.

2017-01-18；改回日期：2017-03-29

青島市公共領域科技支撐計劃項目(12-1-3-49-nsh)資助。

王娜(1990-)，女，山東德州人，在讀碩士。E-mail： air_wn1990@126.com

*通信作者Corresponding author. E-mail： liuqingchao7205@126.com

毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)植物花色豐富、花期長，有較高的觀賞價值[1]和較強的抗逆性[2-3]，此外其藥用價值也不可忽視[4-5]。鐵線蓮屬植物廣泛分布于世界各地，約有340多種，其中我國有140多種，而這些寶貴的資源是鐵線蓮種質創新與遺傳改良的物質基礎。