5株優良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質的影響

雷趙民，王建福，吳建平，何軼群，吳潤，姜輝，萬學瑞*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

5株優良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質的影響

雷趙民1，王建福1，吳建平1，何軼群2，吳潤2，姜輝1，萬學瑞2*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

為了探討具有優良抑菌活性的乳酸菌對全株玉米青貯過程不同時期營養品質的影響，進一步驗證并篩選出可提高玉米秸稈青貯品質的乳酸菌接種劑，將實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得的5株產酸快、多，且具有抑菌活性的優良乳酸菌分別添加到全株玉米秸稈中進行青貯，共設置6個試驗組，分別在青貯第3、7、15、30天測定產物的干物質(DM)、粗蛋白(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和氨態氮(NH3-N)含量及第30 天乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。結果顯示，發酵30 d后，5個處理組的DM、CP、ADF和LA含量顯著高于對照組(Plt;0.05)，NH3-N和WSC含量顯著低于對照組(Plt;0.05)，B3-1組NDF顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著(Pgt;0.05)，B3-1和B5-2組AA含量顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著(Pgt;0.05)；各組DM、CP、WSC含量均隨發酵時間延長而降低，而ADF、NDF和NH3-N含量均隨發酵時間的延長而升高；B3-1組在玉米秸稈全株青貯發酵各期的發酵品質和營養品質最優。以上結果表明5株乳酸菌均能顯著改善青貯飼料發酵品質，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。

全株玉米；營養品質；植物乳桿菌B3-1；發酵品質

青貯過程是一個復雜的微生物發酵體系，如何快速的讓乳酸菌迅速地成為優勢菌群主導發酵過程是提高青貯質量，減少干物質和能量損失的核心問題，為彌補發酵底物中乳酸菌數量的不足，添加優良乳酸菌以調控該微生物發酵體系是一個行之有效的方法，已經有許多成功的例子[1-2]。如在意大利黑麥草(Loliummultiflorum)中添加乳酸菌使pH值及揮發性氮與全氮比值降低，提高了L(+)乳酸的生成比率，改善了青貯飼料發酵品質[3]。一般認為，同型發酵乳酸菌因乳酸產率高，能迅速降低青貯飼料的pH值而抑制有害微生物的活動，從而能改善青貯飼料的發酵品質；異型發酵乳酸菌雖然累積乳酸的能力不如同型發酵乳酸菌，但其除了能產生乳酸外，還可產生能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的乙酸，從而抑制青貯開封后的二次發酵，提高有氧穩定性，減少取用和飼喂過程中的營養損耗[4-7]。目前，已報道能提高青貯飼料有氧穩定性的乳酸菌主要是布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，如全株玉米(Zeamays)中添加布氏乳桿菌進行青貯，可降低青貯飼料的乳酸濃度，提高乙酸濃度，降低酵母菌數量，提高青貯飼料的有氧穩定性[8]。目前，國內外已有許多生物添加劑成功應用于飼料青貯，但由于這種生物添加劑受環境影響較大，出現了一些不同的研究結果[9]。因此，篩選更多的能促進青貯發酵、改善青貯飼料品質并具有抑制青貯飼料二次發酵潛力的優勢乳酸菌勢在必行。

作為青貯添加劑的優良乳酸菌必須具有較強的附著能力和生長能力[10]，而從青貯原料或青貯飼料中分離篩選乳酸菌最容易滿足以上要求。雖然關于玉米青貯的乳酸菌已有較多報道[11-12]，但還沒有適合甘肅地區全株玉米青貯的乳酸菌接種劑，本實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得5株青貯用優良乳酸菌，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B3-1產酸較快、較多，且其培養上清液對供試的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌、大腸桿菌和酵母菌均具有較強的抑菌活性，腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)B2-3、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E2-3分別在分離的同類型乳酸菌中產酸和抑菌特性均最優[13]。分別將以上5株乳酸菌作為接種劑，在實驗室條件下開展全株玉米青貯試驗。結果發現，在青貯過程和有氧暴露后，分別添加5種篩選乳酸菌的各處理組乳酸菌總數均顯著高于對照組，而好氧細菌、酵母菌和霉菌數量均顯著低于對照組，pH亦低于對照組，其中植物乳桿菌B3-1處理組差異最為顯著，表明這5株乳酸菌尤其植物乳桿菌B3-1具有提高青貯飼料品質和抑制二次發酵的潛力[14]。為驗證其對全株玉米青貯發酵過程營養和發酵品質的影響，本研究通過跟蹤分析青貯過程不同階段青貯飼料的營養成分、有機酸和氨態氮的動態變化，綜合評價接種的乳酸菌對全株玉米青貯的調控效果，進一步驗證和篩選在青貯發酵過程不同階段起主要作用的優良乳酸菌，為進一步組合制備更適合甘肅地區全株玉米青貯用復合乳酸菌接種劑提供依據。

1 材料與方法

1.1菌種與儀器

供試乳酸菌包括：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1、屎腸球菌B5-2、發酵乳桿菌E2-3均由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2青貯飼料的調制

2012年9月，自甘肅農業大學動物科學技術學院產學研基地(甘肅省臨洮縣)采集蠟熟期青貯用全株玉米，經切割機切成1～2 cm左右混勻即為青貯原料，用微波爐進行快速干燥，以掌握含水量，當萎蔫至含水量達到70%左右(過夜)進行青貯。各供試乳酸菌用MRS(deMan-Rogosa-Sharpe)液體培養基培養至對數生長期，調濃度為1×109cfu/mL，按5 mL/kg青貯原料添加，即5×106cfu/g。試驗設6個處理：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7組(B1-7)；戊糖片球菌B2-3組(B2-3)；植物乳桿菌B3-1組(B3-1)；屎腸球菌B5-2組(B5-2)；發酵乳桿菌E2-3組(E2-3)；不添加乳酸菌的液體MRS培養基為對照組(CK)。

將菌液用滅菌噴壺均勻噴灑于切碎的玉米秸稈上混勻。按500 g/袋裝入聚乙烯包裝袋中，按緊、壓實，利用真空封口機抽氣封口，每個處理30個重復。于恒溫環境(20 ℃)中進行發酵，分別在青貯第3、7、15、30天取樣，每處理每次隨機取3袋，測定相關指標。

1.3營養成分分析

采集的青貯樣品于65 ℃烘干后粉碎過0.425 mm(40目)篩，干物質(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)等的分析按照《動物營養學實驗教程》中的方法進行[15]。

1.4發酵品質分析

乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)的含量分析采用液相色譜法[5]，在蘭州大學化學測試中心進行；氨態氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行[16]，以NH3-N 占總氮(total nitrogen，TN)的百分比表示[16]。

1.5統計分析

已于2018年8月7日重新生效的第1245條要求，總統對“被認定為在明知情況下直接或間接向伊朗銷售、供應、轉移，或從伊朗轉移會被應用于能源領域的石墨、金屬原料或半成品金屬（例如鋁、鋼、煤，以及集成工業過程中使用的軟件）”的人實施至少5項報復性制裁。

用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較，試驗結果采用平均值±標準差表示，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1玉米青貯原料營養成分

青貯前全株玉米粉碎后測定的營養成分結果如表1所示，原料的含糖量和含水量符合青貯飼料調制要求。

2.2不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段DM的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段DM的影響見表2，各處理組和對照組的DM含量隨發酵進行逐漸減小，青貯前7 d各處理組DM含量與對照組差異不顯著；從第15天開始有差異，到第30天時各處理組的DM含量與對照組相比均差異顯著(Plt;0.05)，其中B3-1處理組的DM含量最高，青貯過程中DM損失最少，為2.22%，而對照組的損失為4.15%。

表1 全株玉米青貯前營養成分Table 1 The chemical compositions of whole crop corn before ensiling

FM: Fresh weight; DM: Dry matter; CP: Crude protein; WSC: Water soluble carbohydrates; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber. 下同The same below.

2.3不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響見表3，隨著青貯時間延長，各處理組和對照組的WSC含量均逐漸降低，前7 d下降較快，之后下降速度減慢，且對照組的WSC含量始終高于各處理組。青貯初期，B1-7處理組和B5-2處理的WSC含量顯著低于其他處理組和對照組，從第15天開始，B3-1處理組的WSC含量最低，與對照組差異顯著(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著。

2.4不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響見表4，各處理組和對照組的CP含量隨青貯時間延長均逐漸緩慢降低，青貯最初7 d，各處理組和對照組的CP含量無顯著差異，從第15天開始，對照組的CP含量顯著低于各處理組；第30天時對照組的CP含量是原料的91.0%，相對下降最多，而 B3-1處理組變化最小，依然含有原料的96.2%。

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)，下同。

Notes: The different letters in the same row mean significant differences atPlt;0.05, the same below.

表3 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響Table 3 Effect of different strains of lactic acid bacteria on WSC in whole corn silage process %, DM

表4 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響Table 4 Effect of different strains of lactic acid bacteria on CP in whole corn silage process %, DM

2.5不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NDF的影響

由表5可見，在青貯過程中，隨著發酵的進行各處理組和對照組的NDF含量均逐漸增加，最初7 d，變化幅度較小，且各組間無顯著差異；從第15天開始，變化幅度明顯增加，其中B3-1處理組變化最大，顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他各處理組差異不顯著(Pgt;0.05)。

表5 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NDF的影響Table 5 Effect of different strains of lactic acid bacteria on NDF in whole corn silage process %, DM

2.6不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段ADF的影響

由表6可見，在青貯過程中，隨著發酵的進行各處理組和對照組的ADF含量均逐漸增加，青貯初期各組間無顯著差異；從第15天開始，B3-1處理組的ADF含量顯著高于其他處理組和對照組(Plt;0.05)，但其他處理組間及其與對照組差異不顯著。

表6 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段ADF的影響Table 6 Effect of different strains of lactic acid bacteria on ADF in whole corn silage process %, DM

2.7不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響見表7，青貯期各處理組和對照組的NH3-N含量均逐漸增加，且對照組始終最高，與各處理組差異顯著(Plt;0.05)，B3-1處理組始終較低。

表7 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響Table 7 Effect of different strains of lactic acid bacteria on NH3-N in whole corn silage process %, TN

2.8不同乳酸菌對全株玉米青貯飼料有機酸的影響

青貯發酵第30 天產物中有機酸含量結果見表8，各處理組及對照組均未檢測到丙酸和丁酸，B3-1、B2-3和B5-2組的LA含量最高，顯著高于對照組和其他兩組(Plt;0.05)，B3-1和B5-2組AA含量最高，顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他3個處理組差異不顯著(Pgt;0.05)。B3-1組LA+AA的含量最高，對照組最低，B2-3組的LA/AA最高，B1-7組LA/AA最低。

表8 不同乳酸菌對全株玉米青貯飼料有機酸的影響Table 8 Effect of different strains of lactic acid bacteria on organic acid in whole corn silage

注：“-”表示未檢出。

Notes: “-” means organic acid was undetected.

3 討論

青貯發酵能否成功取決于以下3個必要條件[10]：適合的微生物菌群結構，即青貯原料中的有益微生物如乳酸菌需達到一定數量，若能達到105cfu/g則有希望獲得品質優良的青貯飼料[17]，而有害微生物如腐敗菌、酵母菌和霉菌等的數量應相對較低；充足的可溶性碳水化合物，提供乳酸菌發酵產酸所需的底物；適當的物理-化學環境，即通過規范的青貯技術和有益微生物的活動創造厭氧和酸性環境。本試驗所使用的全株玉米收獲切割后萎蔫至含水量為71.14%，可溶性碳水化合物含量為干物質的14.92%，可滿足秸稈類作物表面附生的乳酸菌及添加的乳酸菌生長繁殖的需要；中性洗滌纖維含量比較高，為干物質的52.17%，這一部分是秸稈類飼料利用率的瓶頸，若青貯添加劑中含有分解這類纖維類物質的酶或產酶微生物，不僅有利于乳酸菌的發酵，還能提高青貯飼料的營養價值。

全株玉米是制作青貯飼料的主要原料，只要掌握好合適的水分含量，青貯就容易成功，但其自身的乳酸菌數量往往較低，不能在較短的時間內快速成為優勢菌群，從而造成青貯原料營養和能量的損失，且開窖后容易發生二次發酵，引起青貯飼料營養和能量的進一步損失，甚至腐爛變質。在青貯過程中加入乳酸菌制劑可以提高其青貯發酵品質[18]，添加植物乳桿菌能顯著降低青貯飼料的pH值并提高乳酸含量[19]，本試驗結果表明，在青貯第30天，添加乳酸菌各處理組的LA和AA含量均顯著高于對照組(Plt;0.05)，表明添加的各乳酸菌均能很好的定植，并能在青貯發酵過程中起到重要的作用；其中同型發酵乳酸菌B3-1、B2-3、B5-2處理組的LA含量相近，顯著高于異型發酵乳酸菌B1-7和E2-3處理組，B3-1處理組最高，這主要是因為同型發酵乳酸菌在青貯發酵過程中的主要產物是乳酸。另外，以上3個同型發酵乳酸菌處理組的AA含量也較高，可能與青貯原料上本來附著的乳酸菌的類型和數量有關，推測原料中附著的乳酸菌可能以異型發酵乳酸菌為主。因原料中附著的乳酸菌數量較大，達到8.61×105cfu/g，與添加的乳酸菌數量相當，因此添加的同型乳酸菌快速產酸，抑制了有害微生物的繁殖，同時有利于附著異型發酵乳酸菌的繁殖，導致LA和AA含量均升高。有研究報道同型乳酸菌發酵能提高青貯飼料品質，但是在青貯窖打開后的有氧穩定性降低了[20-21]，是因為乙酸的產量較低，降低了其抑制霉菌等有害菌的能力，故在青貯發酵試驗中乙酸的產量增加也不能片面地認為青貯品質降低。

在青貯發酵初期，各添加乳酸菌的處理組DM、CP、NH3-N、NDF、ADF和WSC的含量與對照組無顯著差異，從青貯第7天開始有變化，到青貯第30天，各處理組的DM、CP、NDF和ADF含量顯著高于對照組，而WSC和NH3-N含量顯著低于對照組，B3-1處理組差異最為顯著，表明青貯發酵過程中添加的和附著的乳酸菌活動消耗了一定量的WSC，同時產生的有機酸抑制了有害微生物活動，抑制了腐敗微生物對含氮化合物的分解，從而減少了DM和CP損失[22-23]，增加了NDF和ADF在干物質中所占比率，其中B3-1處理組的DM損失僅為2.22%，CP損失為3.8%，NH3-N占總氮的6.05%，小于10%[24]，品質最優。

4 結論

添加乳酸菌能有效地增加全株玉米青貯過程中LA、AA的含量，減少CP損失，降低NH3-N含量，顯著改善了青貯飼料發酵品質，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。

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Effectof5strainsofLacticacidbacteriawithantibacterialactivityonthecornsilagequality

LEI Zhao-Min1, WANG Jian-Fu1, WU Jian-Ping1, HE Yi-Qun2, WU Run2, JIANG Hui1, WAN Xue-Rui2*

1.College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2.College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

To investigate the effect of lactic acid bacteria (LAB) with antibacterial activity on the quality of corn silage during ensiling, and screen LAB inoculant that could improve the quality of silage, 5 strains of LAB (B1-7, B2-3, B3-1, B5-2, E2-3) isolated from corn silage across Gansu province were added to make corn silage, the contents of dry matter (DM), crude protein (CP), water soluble carbohydrates (WSC), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), ammonia nitrogen (NH3-N), lactic acid (LA), acetic acid (AA), propionic acid (PA) and butyric acid (BA) were analyzed. Results showed that for silage at 30 days, the content of DM, CP, ADF and LA was significantly increased in 5 LAB strains treatment groups compared with the control group, and the content of NH3-N and WSC was decreased. The NDF content in silage inoculated with the B3-1 LAB strain was significantly higher than the control (Plt;0.05), with the other 4 LAB strains being intermediate, while the content of AA in B3-1 and B5-2 treated silages was significantly higher than the control but not the other 3 treatment groups. Along with the fermentation time the content of dry matter, crude protein, water soluble carbohydrates in silages of each group was decreased and the content of ADF, NDF and NH3-N increased. Overall, the silages inoculated with the B3-1 strain showed best fermentation quality and nutritive value characteristics. These results indicated that all added LAB strains improved the quality of silage, withLactobacillusplantarumB3-1 being the most effective.

whole corn; silage quality;LactobacillusplantarumB3-1; ferment quality

10.11686/cyxb2017145http//cyxb.lzu.edu.cn

雷趙民, 王建福, 吳建平, 何軼群, 吳潤, 姜輝, 萬學瑞. 5株優良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質的影響. 草業學報, 2017, 26(11): 77-84.

LEI Zhao-Min, WANG Jian-Fu, WU Jian-Ping, HE Yi-Qun, WU Run, JIANG Hui, WAN Xue-Rui. Effect of 5 strains of Lactic acid bacteria with antibacterial activity on the corn silage quality. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 77-84.

2017-03-28；改回日期：2017-05-31

甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目(GNSW. 2012-25)，農業部公益性行業科研專項(20130305907)，蘭州市科技局科技計劃項目(農業科技攻關；2012-2-159)，農業部公益性行業科研專項(201503134)，甘肅省科技重大專項(143NKDC017)，甘肅省農牧廳秸稈飼料化利用研究專項([2016]269號)和甘肅省科技重大專項“肉牛高效生態營養技術體系研究與示范”(17ZD2NC020)資助。

雷趙民(1967-)，男，甘肅正寧人，教授。E-mail：leizm@gsau.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail：383921499@qq.com