一株產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌的篩選、鑒定及發酵優化

來蔣麗 劉姝， 胡晟源 顧張慧 王淑軍 房耀維，

（1. 淮海工學院海洋生命與水產學院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發研究院，連云港 222005）

一株產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌的篩選、鑒定及發酵優化

來蔣麗1劉姝1，2胡晟源1顧張慧1王淑軍2房耀維1，2

（1. 淮海工學院海洋生命與水產學院，連云港 222005；2. 江蘇省海洋資源開發研究院，連云港 222005）

利用對硝基-N-乙酰苯胺篩選培養基從海州灣海域海泥中篩選獲得產幾丁質脫乙酰酶細菌MCDA02。經過形態學、生理生化和16S rDNA序列分析初步鑒定該菌株為解角質素微桿菌。通過單因素優化和正交試驗優化，得出最優發酵條件。在單因素優化基礎上，利用正交試驗優化獲得菌株MCDA02最優發酵條件為發酵溫度25℃，培養基起始pH7.0，裝液量50 mL/250 mL，幾丁質3%，發酵時間48 h。在此發酵條件下，菌株MCDA02發酵水平達到158.47 U/mL，是優化前的3.2倍。試驗結果為菌株MCDA02幾丁質脫乙酰酶的進一步研究奠定基礎。

幾丁質脫乙酰酶；海洋細菌；鑒定；產酶條件

幾丁質普遍存在于昆蟲的外骨骼，甲殼類動物的殼，大多數真菌和部分藻類的細胞壁，是僅次于纖維素居世界第二的天然有機生物大分子［1］。僅在水生生態系統，幾丁質每年的產量就超過1011t［2］。幾丁質難溶于水和有機溶劑，在工業上難以應用［3，4］。幾丁質脫乙酰度達到55%以上得到殼聚糖。殼聚糖分子中有大量游離氨基，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并具有抗癌、降低膽固醇、降血壓等生物活性，廣泛應用于食品、醫藥、輕工、環保和農業等領域［5，6］。

幾丁質脫乙酰基生成殼聚糖有化學和生物兩種方法。化學法需耗費大量的40%NaOH，產品質量不均一，且導致環境惡化［7］。生物法是利用幾丁質脫乙酰酶（Chitin deacetylase，E.C. 3.5.1.41）催化幾丁質脫乙酰基。對比化學方法，生物法條件溫和，脫乙酰程度一致，且綠色環保。此外，將幾丁質脫乙酰酶與幾丁質酶聯用，可以生產出化學法不能生產的具有特定乙酰化位置，以及分子質量分布范圍窄的殼聚糖產品［8-10］。

目前，產幾丁質脫乙酰酶的真菌菌株報道較多，有被孢霉屬［11］、根霉屬［12］、帚霉屬［13］等。產幾丁質脫乙酰酶的細菌有產堿桿菌屬［14］和紅球菌屬［15］。相對于真菌，細菌產幾丁質脫乙酰酶速率更快［5，16］。目前報道的幾丁質脫乙酰酶存在產酶活力低、脫乙酰效果差，催化溫度較高等問題［17］。海洋中存在大量幾丁質，蘊含著大量分泌幾丁質脫乙酰酶的微生物。因此，本研究從海洋樣品中篩選產低溫幾丁質脫乙酰酶細菌，對菌株進行鑒定和發酵條件研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 海泥樣品采集于中國黃海海州灣燕尾港海域，采集后置于冰盒，并盡快帶回實驗室進行試驗研究。

1.1.2 培養基 （1）2216E培養基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，FePO40.1 g/L，瓊脂20 g/L，陳海水配制，pH7.0；（2）篩選培養基：膠體幾丁質 2 g/L，K2HPO40.7 g/L，KH2PO40.3 g/L，MgSO40.5 g/L，對硝基-N-乙酰苯胺0.2 g/L，陳海水配制，pH7.0；（3）種子培養基：酵母粉1 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 10 g/L，陳海水配制，pH7.0；（4）發酵培養基：玉米漿5 g/L，可溶性淀粉 3 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.5 g/L，粉末幾丁質10 g/L，陳海水配制，pH 8.0。

1.1.3 藥品與儀器 幾丁質由江蘇澳新生物工程有限公司提供，其它生化試劑均為分析純購于上海博微生物科技有限公司，引物由南京思普金生物公司合成。高速冷凍離心機購于美國SIGMA公司，分光光度計購于杭州明基科學儀器有限公司，Nikon 90i全電動顯微鏡購于上海普赫光電科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選 稱取1 g海泥，加入9 mL滅菌陳海水，攪拌均勻后用滅菌陳海水進行10倍濃度梯度稀釋。分別吸取10-4、10-5、10-6的稀釋液100 μL涂布3個平板。平板倒置于25℃培養，觀察菌落生長及變色圈產生情況。挑選產生黃色變色圈的菌株在2216E培養基三區劃線純化至單菌落后，斜面保藏。菌株接種于種子培養液培養，再以1%的接種量接種至發酵培養基，25℃，180 r/min培養60 h后，將發酵液8 000 r/min離心10 min，上清液作為粗酶液測定幾丁質脫乙酰酶活性。

1.2.2 菌株MCDA02的鑒定 根據伯杰氏細菌鑒定手冊，對純化培養的菌株MCDA02進行形態學觀察和生理生化鑒定［18］。

1.2.3 菌株的16S rDNA序列擴增及分析 利用基因組提取試劑盒提取菌株的基因組，進行16S rDNA的擴增。PCR通用引物為：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應體系為：PCR mix（21 μL），上下游引物（各 1 μL），DNA 模板（2 μL）。反應程序 ：94℃ 變性 5 min；94℃變性 30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環；72℃終延伸10 min。

擴增產物送至南京思普金生物公司進行測序，所得的序列上傳GenBank。通過Blast程序與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，并用MEGA7.0軟件中的Neighbor-Joining法構建進化樹。1.2.4 單因素試驗優化發酵產酶條件 將種子液以1%接種量接種至起始pH為8.0的發酵培養基。以25℃、裝液量30%、180 r/min發酵60 h為基本條件，分別對發酵時間、發酵溫度、裝液量、起始pH、誘導劑濃度進行單因素優化。

1.2.5 正交法優化發酵產酶條件 采用正交法得出菌株的最佳發酵條件。選擇發酵時間、溫度、起始pH、裝液量、誘導劑濃度為5個單因素，每個因素取4個水平，測定幾丁質脫乙酰酶的酶活，進行L16（45）正交試驗，每個試驗重復3次。1.2.6 幾丁質脫乙酰酶酶活力的測定 試管中加入30℃預保溫的0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液3 mL，200 mol/L的對硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，酶液1 mL，于30℃水浴反應15 min，沸水浴終止酶促反應，8 000 r/min離心10 min，測定上清液的吸光度。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液作為對照。酶活單位（U）定義：在上述反應條件下每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.7 數據處理與分析 每組試驗設3組平行，重復試驗3次，試驗結果用平均值±標準方差（±s）（n=3）表示，采用SPSS Statistics19.0軟件對試驗結果進行統計分析。

2 結果

2.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選和鑒定

2.1.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選 將稀釋的土樣涂布于含對硝基-N-乙酰苯胺的篩選培養基，挑選產生黃色變色圈的菌落，獲得能夠產生變色圈的菌株5株。菌株MCDA02產生的黃色變色圈見圖1。用接種環將產生變色圈的菌株接入種子培養液培養24 h后，以1% 接種量接種至發酵培養基，25℃，180 r/min培養60 h。發酵液8 000 r/min離心10 min，測定發酵上清中幾丁質脫乙酰酶的酶活。結果見表1，菌株MCDA02酶活最高，達到48.13 U/mL。

圖1 菌株MCDA02在篩選平板上生成的變色圈

表1 菌株產幾丁質脫乙酰酶酶活

2.1.2 菌株MCDA02的形態學特征 菌株MCDA02接種于2216E固體培養基，25℃培養48 h后，菌落形態為黃色，半透明，表面光滑濕潤，圓形，邊緣齊整，中心稍突起，易挑取（圖2-A）。對菌株MCDA02進行革蘭氏染色觀察，該菌株為革蘭氏陽性短桿菌，無芽孢（圖2-B）。

圖2 菌株MCDA02的形態學特征

2.1.3 菌株MCDA02的生理生化特征 菌株MCDA02的生理生化特征見表2。該菌株淀粉水解、吲哚試驗、硫化氫產生、精氨酸脫羧酶試驗均呈陽性，檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化、VP試驗、甲基紅、硝酸鹽還原試驗均為陰性。

表2 MCDA02菌株的生理生化試驗結果

2.2 菌株MCDA02的16S rDNA鑒定

將菌株MCDA02的16S rDNA擴增產物測序獲得的1 395 bp序列提交至GenBank（登錄號：KY385626），并與GenBank數據庫中序列進行同源性比對，發現與菌株Microbacterium keratanolyticum OU01（登錄號：DQ118082.1）16S rDNA相似性達100%。構建系統發育樹見圖3，菌株MCDA02與Microbacterium keratanolyticum OU01親緣關系最近。

圖3 基于MCDA02菌株16S r DNA序列構建的系統發育樹

2.3 單因素試驗優化發酵產酶條件

2.3.1 發酵時間對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響 發酵時間對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響如圖4。發酵時間達到48 h時，其相對酶活達到最高。隨著發酵時間的進一步增加，酶活呈下降趨勢。

圖4 發酵時間對菌株MCDA02產酶的影響

2.3.2 發酵溫度對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響 發酵溫度對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響如圖5，幾丁質脫乙酰酶酶活從10℃開始隨發酵溫度的升高而增大，在25-35℃范圍內酶活較高，最適發酵溫度為30℃，當發酵溫度達到40℃以上時，酶活開始迅速下降。

圖5 發酵溫度對菌株MCDA02產酶的影響

2.3.3 培養基起始pH對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響 培養基起始pH對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響如圖6，發酵產酶的最適pH為8.0，培養基的起始pH為4.0或11.0時，該酶的相對酶活較低。但在pH為7.0-9.0時，酶活較高，可保持90%以上的酶活。

2.3.4 裝液量對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響 裝液量對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響如圖7，裝液量在10%-20%之間時，菌株MCDA02所產幾丁質脫乙酰酶的相對酶活較高。裝液量高于20%時，酶活下降顯著。

2.3.5 誘導劑濃度對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響 誘導劑濃度對菌株MCDA02產幾丁質脫乙酰酶的影響如圖8。粉末幾丁質濃度為0.5%-3.0%時，其相對酶活呈上升趨勢。粉末幾丁質濃度為3.0%-6.0%時，呈下降趨勢。誘導劑的最適濃度為3.0%。

圖6 起始pH對菌株MCDA02產酶的影響

圖7 裝液量對菌株MCDA02產酶的影響

圖8 幾丁質濃度對菌株MCDA02產酶的影響

2.4 正交法優化發酵產酶條件

L16（45）的正交試驗結果見表3。根據試驗結果，計算kn值和R值，得出的最優發酵方案為：幾丁質濃度為3%，培養基起始pH為7.0，裝液量為20%，在溫度為25℃的條件下發酵培養48 h。在此發酵條件下，菌株MCDA02發酵水平達到158.47 U/mL，是優化前的3.2倍。影響發酵結果的5個因素中，發酵溫度、培養基起始pH、誘導劑濃度的R值較大，發酵時間、裝液量的R值較小。對比各個因素及交互對比的極差R的大小，5個因素對發酵結果的影響力依次為：發酵溫度＞誘導劑濃度＞培養基起始pH＞發酵時間＞裝液量。

3 討論

采用生物法，利用殼甲殼素制備殼聚糖較傳統化學方法優勢明顯。篩選幾丁質脫乙酰酶產生菌，發酵制備幾丁質脫乙酰酶是生物法制備殼聚糖的前提條件［12］。目前幾丁質脫乙酰酶產生菌以絲狀真菌居多，細菌較少。研究發現細菌幾丁質脫乙酰酶產酶水平較高。目前報道的多數幾丁質脫乙酰酶活性較低，催化最適溫度高［16］。海洋里還有大量的幾丁質，且環境奇特多樣，蘊含有大量的催化特性不同的幾丁質脫乙酰酶產生菌，成為該酶產生菌的研究熱點。

微生物發酵條件對菌株產酶有顯著的影響，通過發酵優化可以顯著提高酶的發酵水平。關于發酵優化提高微生物產酶的報道與日俱增，取得了顯著的成果。目前尚未見解角質素微桿菌產幾丁質脫乙酰酶的報道。本研究通過發酵條件優化后該菌株發酵水平達到158.47 U/mL，具有工業化應用的潛力。

微生物發酵條件對菌株產酶有顯著的影響，通過發酵優化可以顯著提高酶的發酵水平。應聰萍等［19］針對已篩選出的一株能生產幾丁質脫乙酰酶的海洋絲狀真菌并研究了其最佳發酵培養基。通過試驗得出該菌的最佳發酵培養基為：7 g/L葡萄糖，7 g/L酵母浸膏，0.75 g/L氯化鈣，1.25 g/L幾丁質和1.4%NaCl，發酵108 h。目前對幾丁質脫乙酰酶理化性質的研究主要集中于溫度、pH 值、金屬離子及反應底物對酶催化的影響，有的研究者也考慮了在培養基中添加生長激素、胰島素等因子提高酶活。

同時，不同性質的底物也影響幾丁質脫乙酰酶的催化活性。本研究將幾丁質通過破碎、高溫等處理后將其作為催化反應的底物。結果表明，經過處理的幾丁質作底物，酶的脫乙酰度顯著提高。多項研究表明乙二醇幾丁質是幾丁質脫乙酰酶作用較為理想的反應底物［12］。

表3 L16（45）正交試驗結果分析

隨著研究者對幾丁質脫乙酰酶研究的逐漸深入。其研究的范圍不僅是從自然界分離純化到幾丁質脫乙酰酶，還可通過基因工程的手段對該酶的基因進行研究。賈志娟［20］通過對北極深海沉積物的宏基因組測序，獲得了一種新的幾丁質脫乙酰酶基因。閆曉萍等［21］利用RACE-PCR的方法獲得了編碼美國白蛾幾丁質脫乙酰酶2基因全長cDNA序列，在大腸桿菌中成功表達61 kD目的蛋白。

今后還可通過定點突變、射線誘變等方法對幾丁質脫乙酰酶進行改造，進一步優化其酶學性質、提高酶的耐受性等，為幾丁質脫乙酰酶實現大規模工業應用奠定基礎。

4 結論

本研究分離得到一株產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌MCDA02，鑒定為解角質素微桿菌。通過單因素和正交優化發酵條件，得到最優發酵條件為：誘導劑濃度為3%，培養基起始pH為7.0，裝液量為20%，在溫度為25℃的條件下發酵培養48 h。在此條件下，產酶量達到158.47 U/mL，是優化前產酶量的3.2倍。

［1］Khor E, Lim LY. Implantable applications of chitin and chitosan［J］. Biomaterials, 2003, 24（13）：2339-2349.

［2］Hou J, Han J, Cai L, et al. Characterization of genes for chitin catabolism in Haloferax mediterranei［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98（3）：1185-1194.

［3］Win N, Stevens W. Shrimp chitin as substrate for fungal chitin deacetylase［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 57（3）：334-341.

［4］Bartnicki-Garcia S, Bracker CE, Reyes E, et al. Isolation of chitosomes from taxonomically diverse fungi and synthesis of chitin microfibrils in vitro［J］. Experimental Mycology, 1978, 2（2）：173-192.

［5］張菁菁, 董文賓, 緱敬軒. 幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選鑒定及酶學性質［J］. 食品工業科技, 2012, 33（6）：244-246.

［6］Songsiriritthigul C, Lapboonrueng S, Pechsrichuang P, et al.Expression and characterization of Bacillus licheniformis chitinase（ChiA）, suitable for bioconversion of chitin waste［J］.Bioresource Technology, 2010, 101（11）：4096-4103.

［7］Methacanon P, Prasitsilp M, Pothsree T, et al. Heterogeneous N-deacetylation of squid chitin in alkaline solution［J］.Carbohydrate Polymers, 2003, 52（2）：119-123.

［8］王皓, 吳麗, 朱小花. 甲殼素脫乙酰酶的研究概況及展望［J］.中國生物工程雜志, 2015, 35（1）：96-103.

［9］Wang SL, Peng JH, Liang TW, et al. Purification and characterization of a chitosanase from Serratia marcescens TKU011［J］.Carbohydrate Research, 2008, 343（8）：1316-1323.

［10］Kuroiwa T, Noguchi Y, Nakajima M, et al. Production of chitosan oligosaccharides using chitosanase immobilized on amylose-coated magnetic nanoparticles［J］. Process Biochemistry, 2008, 43（1）：62-69.

［11］Zhao Y, Nguyen V, Jo G, et al. Purification and characterization of chitin deacetylase from Mortierella sp. DY-52［J］. Journal of Biotechnology, 2008, 136：S304.

［12］Chatterjee S, Chatterjee S, Chatterjee BP, et al. Enhancement of growth and chitosan production by Rhizopus oryzae in whey medium by plant growth hormones［J］. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 42（2）：120-126.

［13］Cai J, Yang J, Du Y, et al. Purification and characterization of chitin deacetylase from Scopulariopsis brevicaulis［J］. Carbohydrate Polymers, 2006, 65（2）：211-217.

［14］Li H, Xu H, Li S, et al. Strain improvement and metabolic flux modeling of wild-type and mutant Alcaligenes sp. NX-3 for synthesis of exopolysaccharide welan gum［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2010, 15（5）：777-784.

［15］Sun Y, Zhang J, Wu S, et al. Statistical optimization for production of chitin deacetylase from Rhodococcus erythropolis HG05［J］.Carbohydrate Polymers, 2014, 102：649-652.

［16］Wang Y, Xia G, Wu C, et al. Porous chitosan doped with graphene oxide as highly effective adsorbent for methyl orange and amido black 10B［J］. Carbohydrate Polymers, 2015, 115：686-693.

［17］劉建軍, 趙祥穎, 劉麗萍. 幾丁質脫乙酰酶（CDA）的研究進展［J］. 山東食品發酵, 2007（4）：40-46.

［18］Buchana RE, Gibbons NE. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology［M］. 8th Edition. Beijing：Science Press, 1984：382-533.

［19］應聰萍, 王瑤, 李永成. 一株產幾丁質脫乙酰酶絲狀真菌的發酵條件優化研究［J］. 食品工業科技, 2016（1）：170-174.

［20］賈志娟. 北極深海沉積物宏基因組文庫構建及一種新的幾丁質脫乙酰酶基因鑒定［D］. 武漢：華中師范大學, 2012.

［21］閆曉平, 趙丹, 郭巍, 等. 美國白蛾幾丁質脫乙酰酶的克隆,表達及酶學性質［J］. 中國農業科學, 2017, 50（5）：849-858.

Screening and Identification of a Marine Bacterium Producing Chitin Deacetylase and Optimization of Its Fermentation Condition

LAI Jiang-li1LIU Shu1，2HU Sheng-yuan1GU Zhang-hui1WANG Shu-jun2FANG Yao-wei1，2
（1. College of Fisheries and Marine Life，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005；2. Jiangsu Marine Resources Development Research Institute，Lianyungang 222005）

A strain MCDA02 producing chitin deacetylase was screened with the media added nitro-N-acetyl aniline from the marine mud of Haizhou bay. Then，it was identified as Microbacterium keratanolyticum through morphological，biochemical characteristics，and 16S rDNA sequence analysis. With single-factor strategy and orthogonal experiments，the fermentation condition was optimized as followings：fermentation period of 48 h，initial pH of 7.0，culture temperature of 30℃，50 mL of liquid medium in a 250 mL flask，and 3% chitin. Under the optimized conditions，the highest chitin deacetylase activity of strain MCDA02 reached 158.47 U/mL，which was about 3.2 times of that before optimization. The results laid a foundation for further study of the chitin deacetylase from the strain MCDA02.

chitin deacetylase；marine bacteria；identification；fermentation condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0413

2017-05-21

江蘇省自然科學基金面上項目（BK20151282），江蘇省高校“青藍工程”，江蘇省“六大人才高峰”第十二批高層次人才項目（swyy-195），中國博士后科學基金（160034），青島博士后基金，第48批“留學歸國人員”科研啟動基金，淮海工學院科研創新基金（Z2014016）

來蔣麗，女，碩士研究生，研究方向：海洋微生物生物技術；E-mail：laijiangli199310@163.com

房耀維，男，副教授，研究方向：海洋微生物生物技術；E-mail：foroei@163.com

（責任編輯 李楠）