利用PCR技術快速檢測根際產ACC脫氨酶細菌

秦媛 潘雪玉 袁志林

（中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，杭州 311400）

利用PCR技術快速檢測根際產ACC脫氨酶細菌

秦媛 潘雪玉 袁志林

（中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，杭州 311400）

通過產生ACC脫氨酶降低脅迫乙烯水平并緩解鹽脅迫危害，是植物根際促生菌（PGPR）促進宿主生長和抗逆的重要機制。本研究提出了利用PCR技術快速檢測產ACC脫氨酶細菌的快捷方法。以編碼ACC脫氨酶的acdS基因為標記，分別使用acdSf3/acdSr4、DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r三對引物，對多種鹽生植物和美洲黑楊（Populus deltoids）的根部及根際土中分離得到的細菌菌株進行檢測。結果表明，結合acdSf3/acdSr4引物和遞減PCR（touchdown-PCR）方法時，能獲得單一的特異性擴增條帶且擴增成功率高；但DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r兩對引物特異性較差。從247個菌株中檢測到25株含有acdS基因，旨為今后研究植物根際細菌acdS基因遺傳性及儲備豐富的功能性菌株奠定基礎。

鹽生植物；楊樹；植物促生長根際細菌；內生細菌；產ACC脫氨酶細菌

鹽脅迫、高溫、干旱、水淹、機械損傷、空氣污染和化學污染等非生物脅迫會引起植物內源脅迫乙烯分泌增多，而過量乙烯導致植物生長發育受阻或死亡［1-3］。1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是乙烯合成的前體物質，而ACC脫氨酶可將ACC分解為氨和α-酮丁酸，降低乙烯濃度，緩解乙烯對植物產生的不良反應，從而促進植物生長發育，提高其耐鹽性［4-8］。在土壤、植物根際和根內生環境中產ACC脫氨酶的細菌是普遍存在的［9-10］，研究表明，植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）、內生細菌（Endophytic bacteria）及木霉菌（Trichoderma sp.）等內生真菌（Endophytic fungi）均可產生ACC脫氨酶［11-12］，尤其是對PGPR而言，利用ACC脫氨酶降低植物體內的乙烯水平，緩解鹽脅迫對植物造成的損傷是其促進植物生長和抗逆的主要機制［5，13-19］。和其他耗時較長，工作量大而效率低的傳統ACC脫氨酶細菌的分離方法相比，通過PCR手段對編碼ACC脫氨酶的acdS基因片段進行擴增的方法，高效快速且靈敏度高，具有良好的應用推廣價值。快速篩選具ACC脫氨酶活性的菌株對于進一步挖掘多功能PGPR菌種資源，制備微生物肥料，促進農林業可持續發展具有著重要的生產應用價值［20-21］。本研究以期從多種鹽生植物以及楊樹根際、根內生部位分離培養所得大量細菌中，通過選擇合適的引物，建立PCR反應體系，快速篩選產ACC脫氨酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根系及根際土樣品采集 采樣地點為山東省青島市黃島區濱海大道風河大橋風河入海口和浙江省杭州市富陽區新登鎮楊樹良種基地，共采集10種鹽生植物：鹽地堿蓬（Suaeda salsa）、砂引草（Messerschmidia sibirica）、腎葉打碗花（Calystegia soldanella）、西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum）、糙葉苔草（Carex scabrifolia）、篩草（Carex kobomugi）、濱 藜（Atriplex patens）、 無 翅 豬 毛 菜（Salsola komarovii）、蘆葦（Phragmites australis）以及地膚（Kochia scoparia）和美洲黑楊（Populus deltoids）的根部及其根際土。將植物樣品和土壤樣品迅速裝入塑封袋中。于冰盒中暫時存放，48 h內運輸至實驗室進行細菌分離培養。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱形），Axygen 生物公司，中國；1-Aminocyclopropane-1-carboxylic Acid（Merck公司）；16S rRNA序列擴增引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.3 培養基 1/10 TSA培養基、PIA培養基、LB培養基、PAF培養基、DF培養基（以硫酸銨或ACC為唯一氮源）和ADF培養基［15］。

1.2 方法

1.2.1 植物根系表面消毒和研磨 用水將植物根系樣品表面的雜物沖洗干凈，再將植物根系樣品修剪成段。在超凈臺中對植物樣品進行表面消毒處理：先用75%的乙醇溶液（按體積比用無菌水稀釋）浸泡樣品1 min，接著用次氯酸鈉溶液（0.5%的活性氯）浸泡樣品5-10 min（具體時間視植物根系的幼嫩程度而定），再將樣品放入裝有90%的乙醇溶液的燒杯中漂洗次氯酸鈉，最后用無菌水沖洗樣品5次。隨后，將已消毒的根系組織剪碎，置于無菌的50 mL離心管中，向管內倒入適量1×PBS緩沖液（以剛沒過樣品為準）。將研磨槍槍頭置于酒精燈外焰上灼燒后于無菌水中冷卻。將上述50 mL離心管插入碎冰中冰浴，將滅菌處理過的研磨槍槍頭伸入管內調至最低檔研磨樣品。另取無菌的50 mL離心管，剪取一塊無菌的紗布封在管口，將所得植物根系樣品勻漿倒入無菌紗布封口的離心管內，得到根系研磨液，5℃冰箱內保存。

1.2.2 根際土的收集 取植物根系樣品，抖落根外土，將帶有根際土的植物根系樣品修剪成段置于裝有1×PBS緩沖液的50 mL離心管中，在離心管外標注好對應的樣品編號。將離心管放置在渦旋振蕩器（Vortex-Genie 2，MOBIO公司）上充分振蕩5 min，使根際土懸浮于緩沖液中。取出根系樣品，將根際土懸浮液10℃下6 000×g離心15 min（德國Sigma 3K15臺式高速冷凍離心機），倒掉上清液，收集根際土，放置于5℃冰箱內保存。

1.2.3 內生細菌和根際細菌的分離純化 本實驗采用傳統連續稀釋法分離植物內生細菌和根際細菌［20］。取1 mL根系研磨液或1 g根際土，加至99 mL 1×PBS緩沖液，重新懸浮并充分混勻，隨后按照1∶10的比例依次進行系列稀釋，分別得到10-3、10-4和10-53個濃度的土壤懸浮液。選取其中10-4和10-5兩個濃度梯度的土壤懸液，充分混勻后各取100 μL，涂布于1/10 TSA、PIA培養基表面。每種培養基不同樣品各濃度重復3次，作好標記。22℃避光培養3-4 d，及時觀察細菌菌落。挑取少量菌體用“連續劃線法”和“三線法”在LB培養基上進行純化，直至出現單菌落。

1.2.4 產ACC脫氨酶細菌的分離和保存 采用富集定向篩選［15］和連續稀釋［22］的方法分離產ACC脫氨酶的細菌。取1 mL根系研磨液或根際土懸浮液，分別經PAF培養基、以硫酸銨或ACC為唯一氮源的DF培養基和ADF培養基進行篩選和培養，最后挑取不同形態的單菌落在LB培養基上劃線純化。

對分離純化后所得細菌進行低溫冷凍保藏，具體方法為：在超凈臺中以鑷子夾取滅菌處理后的牙簽從LB培養基上挑取細菌單菌落，放入50 mL液體LB培養液中，在28℃旋轉搖床200 r/min條件下液體發酵12 h后，收集1 mL菌液以5 000×g轉速離心10 min，棄去上清液，將菌體溶于滅菌處理過的50%甘油，利用移液槍吹打混勻后，將所得懸濁液加入冷凍管中于超低溫冰箱（-70℃）中保藏。

1.2.5 細菌基因組的提取和PCR擴增 挑取細菌單菌落至LB培養基中，28℃振蕩培養至對數期取適量菌液，以5 000×g轉速離心收集菌體，使用細菌基因組提取試劑盒，依照其步驟提取基因組。使用Q5000超微量紫外分光光度計（美國Quawell公司）測定DNA 濃度，并根據OD260/280比值檢測樣品DNA純度，-20℃保存樣品。

以細菌基因組DNA為模板，對16S rRNA片段基因進行PCR擴增。引物為細菌16S rRNA通用引物356F和1064R，擴增區域為V3-V5可變區，擴增體系共 50 μL，其中模板 3 μL（約 50 ng），正向反向引物各 0.5 μL（濃度 50 μmol/L），25 μL 2×Taq MasterMix（不含染料）（北京康為世紀生物科技有限公司），最后用無菌去離子水補足至50 μL。PCR擴增條件為90℃預變性4 min；94℃變性40 s，58℃退火50 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產物用1.0%的瓊脂糖凝膠分離，再用DNA純化試劑盒（Axygen 生物公司，中國）對目的片段進行膠回收并送至杭州擎科生物有限公司測序。

1.2.6 利用PCR技術篩選產ACC脫氨酶的細菌 提取富集篩選得到的細菌菌株的DNA溶液作為PCR反應的模板，選擇合適的引物來PCR擴增acdS片段從而篩選具ACC脫氨酶活性的細菌。本研究參考相關文獻選用DegACCf/DegACCr、F1936f/ F1938r和acdSf3/acdSr4三對引物［23-25］，引物信息詳情見表1。

（1）DegACCf和 DegACCr 使 用 DegACCf和DegACCr這對引物進行PCR擴增，采用50 μL體系：上下游引物DegACCf和DegACCr各加0.5 μL，DNA模板 3 μL，2×Taq-MasterMix 25 μL 和 21 μL 去離子水。PCR擴增程序設置為：90℃預變性4 min；95℃變性40s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35次循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴增所得產物直接進行1%瓊脂糖凝膠（m/V）電泳檢測。（2）F1936f和F1938r 使用F1936f和F1938r這對引物進行PCR擴增，采用50 μL體系：上下游引物F1936f和 F1938r各 加 0.5 μL，DNA 模 板 3 μL，2×Taq-MasterMix 25 μL及 21 μL去離子水。PCR 程序設置為：90℃預變性4 min；95℃變性40 s，51℃退火1 min，72℃延伸1 min，35次循環；72℃延伸5min；4℃保存。PCR擴增所得產物直接進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。（3）acdSf3和acdSr4 使用acdSf3和acdSr4這對引物，采用50 μL PCR擴增體系：上下游引物 acdSf3和 acdSr4各加 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，2×Taq-MasterMix 25 μL 及 22 μL 去離子水。采取遞減PCR（touchdown-PCR）的方法：94℃預變性10 min；94℃變性40 s，65℃退火50 s，72℃延伸1 min，每個循環退火溫度降低0.4℃，15個循環后退火降至58℃，循環20次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增所得產物直接進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。（4）acdS基因克隆測序 將電泳后所得與目的片段大小一致的條帶切膠，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行TA克隆測序。

表1 本研究中使用的引物名稱、序列及退火溫度

1.2.7 核苷酸序列比對和系統發育分析 16S rRNA和acdS基因測序結果用BioEdit v7.0.9和Genedoc v2.7.0等序列比對軟件進行編輯，去除兩端不準確序列后，在GenBank數據庫中用BLAST功能（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行相似性搜索和同源性比對。調取匹配度較高的已登記菌株相應序列，通過ClustX1.81軟件進行多序列比對，利用MEGA v5.1軟件通過Neighbor-Joining法分別構建基于16S rRNA和acdS基因的系統發育進化樹。其中，構建16S rRNA系統發育樹時選擇Asticcacaulis solisilvae、A.benevestitus、A. exxentricus和 Brevundimonas sp.作 為外群，構建acdS基因系統發育樹時選擇Rhizobium leguminosarum、R. gallicum、Sinorhizaobium meliloti和Pseudomonas sp.作為外群。生成outree文件后，使用FigTree v1.4.2軟件（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對系統發育樹進行編輯和注釋。1.2.8 acdS基因編碼的氨基酸序列的比對與系統發育分析 acdS基因原始序列進行編輯，與GenBank數據庫中已描述菌株對比，去除核苷酸序列內含子，得到編碼ACC脫氨酶氨基酸的基因序列。去除內含子的基因序列進行blastx和Protein BLAST搜索，調取匹配度高的已知菌株acdS基因序列及氨基酸序列，通過ClustX1.81軟件進行多序列比對，利用MEGA v5.1軟件選用Poisson Correction模型構建基于細菌acdS基因核苷酸和氨基酸序列的系統發育進化樹。

2 結果

2.1 鹽生植物和楊樹根際根內生細菌分離情況

經分離純化、富集培養和16S rRNA分子鑒定（圖1-A），從10種鹽生植物和楊樹樣品中所得根際細菌154株，根內生細菌93株，共計247株。基于其16S rRNA片段在NCBI數據庫進行BLAST比對，對其分類地位進行初步鑒定，結果顯示其中243個菌株屬于變形菌門（Proteobacteria），分 屬 于 γ變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、β變 形 菌 綱（Betaproteobacteria）、α變 形 菌 綱（Alphaproteobacteria）；剩余4個菌株屬于厚壁菌門（Firmicutes）芽胞桿菌綱（Bacilli）。各個分類單元中，內生細菌和根際細菌所占比例相當，無明顯差異。內生細菌和根際細菌宿主和類別分布無明顯規律，說明其宿主特異性較低。

2.2 引物篩選結果

PCR擴增產物電泳結果顯示，使用引物對DegACCf/DegACCr擴增出現較多非特異性條帶且各片段大小不一，提高退火溫度后，非特異性條帶較多，且具有假陽性現象。使用引物對F1936f/F1938r的PCR擴增產物電泳結果中特異性條帶較多，其中大小在790 bp左右的條帶較多，但克隆測序結果表明擴增出的片段不是目的基因acdS基因。acdSf3和acdSr4引物的PCR擴增產物電泳結果中，條帶清晰且特異性較好，片段大小在750 bp左右，與目的片段相符，擴增成功率高（圖1-B）。因此，本實驗最終確定采用的是acdSf3/acdSr4引物對及其PCR反應體系。

圖1 基于16S rRNA和acdS基因對16個代表性菌株PCR擴增產物電泳圖譜

2.3 篩選得到25個產ACC脫氨酶的菌株

采用acdSf3/acdSr4引物對及其PCR反應體系，對編碼ACC脫氨酶的acdS序列基因片段進行擴增和克隆測序，結果顯示，其中25株細菌的基因組中可擴增出acdS基因。該25株菌株相關信息及16S rRNA、acdS基因的GenBank登錄號，見表2。

2.4 具ACC脫氨酶活性細菌16S rRNA序列的分析

基于16S rRNA構建的系統發育樹中可以看出（圖2），具ACC脫氨酶活性的24株根際細菌和1株內生細菌分布于β變形菌綱（Betaproteobacteria）的伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、貪銅菌屬（Curiavidus sp.）、多嗜菌屬（Variovorax sp.）和無色桿菌屬（Achromobacter sp.），以及γ變形菌綱（Gamaproteobacteria）的假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）和鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）內，共計2個綱6個屬。在歸類于β變形菌綱的15株細菌中，宿主植物為鹽生植物根際或根系的8個細菌全部分布于無色桿菌屬，且親緣關系較近；而伯克氏菌屬、貪銅菌屬和多嗜菌屬內則均為楊樹根際細菌。γ變形菌綱10個細菌中，9個分離自鹽生植物或楊樹根際的細菌屬于假單胞菌屬，且屬內多樣性較豐富。系統發育樹中步移值大于等于50的在分支節點標出，分支長度與同源進化呈正比關系。

2.5 具ACC脫氨酶活性細菌acdS序列的分析

使用acdSf3和acdSr4這對引物對acdS基因擴增，獲得相應基因片段，去掉內含子并翻譯為相應氨基酸序列后在NCBI數據庫內與已報道菌株進行BLAST比對，結果顯示同源性為93%-99%（表3），基于acdS核苷酸和氨基酸序列構建的系統發育樹分別如圖3和圖4所示。

通過基于acdS基因核苷酸序列構建的系統發育樹（圖3）和基于acdS基因編碼的氨基酸序列構建的系統發育樹（圖4）可看出，25株具ACC脫氨酶活性的細菌主要可歸類于兩大基因簇。系統發育樹中上部分基因簇中16個菌株分屬4個亞群，其 中 LW-RS-PIA-1、LW-RS-PIA-3、SYC-RS-TSA-3和SYC-RS-PIA-6等4個假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細菌同源性較高，功能最為相近，DF-RS-PIA-3及XDPOP-RS-TSA-17兩個假單胞菌（Pseudomonas sp.）與LW-RS-PIA-1等4個假單胞菌的同源性較為 接 近；而 XDPOP-RS-TSA-8（Pseudomonas sp.）、XB-RS-PIA-11（Halomonas sp.）則各形成一個相對獨立的分支。XDPOP-RS-PIA-16和XDPOP-RSPIA-1（Burkholderia sp.）屬于一個亞群，從圖3中可看出該亞群與其它3個亞群的同源性較近，但是從圖4中可看出該亞群形成較獨立分支，功能較為特殊。中下部分基因簇中包含9個菌株，由圖 3所 示，DW-RS-PIA-1、DF-RS-PIA-1、DF-RSACC-6、LW-RS-ACC-3、SYC-RS-TSA-4等 5個 無色 桿 菌（Achromobacter sp.） 及 XDPOP-RS-TSA-16（Pseudomonas sp.）同源性較高，為一個亞群，由圖4所示，XDPOP-RS-TSA-16（Pseudomonas sp.）在功能上形成一個獨立的分支；另外，由圖3、圖4中可看出，SYC-RS-PIA-8和SYC-RS-PIA-9兩個無色桿菌（Achromobacter sp.）與 JP-R-ACC-12（Pseudomonas sp.）為另外一個亞群，功能相近同源性較高。

表2 具ACC脫氨酶活性菌株相關信息及16S rRNA和acdS基因登錄號

圖2 基于16S rRNA構建系統發育進化樹

表3 具ACC脫氨酶活性細菌氨基酸序列BLAST比對及相似性分析

3 討論

圖3 基于acdS基因構建系統發育進化樹

圖4 基于acdS基因序列編碼的氨基酸序列構建系統發育進化樹

本研究對10種不同鹽堿地指示性鹽生植物以及楊樹根際、根系內部進行分離培養和分子鑒定，共獲得247株細菌，歸類于4大綱10個目，多樣性較豐富。并通過篩選引物、優化PCR反應條件等方法建立了一套從中穩定高效的快速篩選具ACC脫氨酶活性細菌的方法。在前人研究基礎上，本實驗選擇了DegACCf/DegACCr、F1936f/F1938r以及acdSf3/acdSr4等3對編碼細菌ACC脫氨酶的acdS基因片段的引物進行擴增［23-25］。最終只有acdSf3/acdSr4引物對可以成功擴增出acdS基因；雖然其余兩對引物在一些報道中被認為行之有效［23-24］，如基于宏基因組方法檢測環境樣品acdS基因的遺傳多樣性，但在本實驗中對純菌株的擴增效果反而不佳，說明在利用PCR技術擴增目標片段時，需要根據實際的實驗情況來選擇合適的引物。基于acdS基因編碼的氨基酸序列進行系統發育分析，可將這些菌株進一步分為兩大類群，某些菌株如XDPOP-RS-PIA-16（Burkholderia sp.）、XB-RS-PIA-11（Halomonas sp.）同源性最低，氨基酸結構的新穎性可能決定了在酶活和功能方面的特殊性，有待于今后進一步探索。

本研究通過PCR檢測手段，發現ACC脫氨酶細菌在根際和根內生環境遺傳多樣性豐富，是一類優質植物促生抗逆微生物資源。在建立具ACC脫氨酶活性的菌株的資源庫的基礎上，今后的研究工作將圍繞定量測試菌株ACC脫氨酶活性展開，旨在篩選出高酶活ACC脫氨酶產生菌，這對增強林木耐鹽性和沿海造林工程等研究都具有重要的科學意義，對進一步開發促生、增強抗逆性的菌劑應用于林木高質量育苗也有良好的應用前景。另外，與耗時長、工作量大而效率低的傳統ACC脫氨酶產生菌分離方法相比，本研究為快速篩選具ACC脫氨酶活性的細菌建立了PCR體系，對同類研究具有較重要的參考價值和指導意義。

4 結論

本研究利用PCR技術，以編碼ACC脫氨酶的acdS基因為標記，分別使用acdSf3/acdSr4、DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r三對引物對多種鹽生植物和楊樹根際、根內生細菌進行檢測，實驗結果表明使用acdSf3/acdSr4引物可有效擴增出細菌acdS基因。利用該PCR技術篩選具有ACC脫氨酶活性的菌株是高效便捷的方法。

致謝：感謝青島農業大學辛華老師在樣品采集過程中提供的幫助。

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PCR-based Method for the Rapid Detection of ACC Deaminaseproducing Rhizosphere Bacteria

QIN Yuan PAN Xue-yu YUAN Zhi-lin
（Institute of Subtropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Hangzhou 311400）

Producing ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate）deaminase to reduce ethylene levels and eliminate salt stress is the key mechanism of plant-growth-promoting rhizobacteria（PGPR）in improving plant growth and stress tolerance. This work aims to establish an expeditious approach to screen bacteria containing ACC deaminase based on polymerase chain reaction（PCR）. We set the acdS gene encoding the ACC deaminase as the probe，then selected three pairs of primers（acdSf3/acdSr4，DegACCf/DegACCr and F1936f/F1938r）respectively，and detected the various bacterial strains isolated from the root and rhizosphere soil of diverse halophytes and Populus deltoids.The results showed that single specific amplified bands were produced and the rate of amplification was high when using the primers acdSf3/acdSr4 combined with touch-down PCR methods；however，DegACCf/DegACCr or F1936f/F1938r was in poor specificity. Finally，we acquired 25 strains containing acds gene from 257 bacterial isolates，aiming at laying a foundation for reserving rich and functional microbial resources and further studying the genetic diversity and function of acdS in PGPR.

halophytes；poplar；plant growth promoting rhizobacteria；endophytic bacteria；ACC deaminase-producing bacterium

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0370

2017-05-09

國家自然科學基金面上項目（31370704），2014 年度國家林業局引智項目，2016 年度留學回國人員科技活動項目擇優資助經費

秦媛，女，碩士研究生，研究方向：林木根際微生物；E-mail：qinyuan0426@foxmail.com；潘雪玉為共同第一作者

袁志林，男，博士，副研究員，研究方向：林木根際微生物；E-mail：yuanzl@caf.ac.cn

（責任編輯 狄艷紅）