花椒揮發油的提取及其抑菌抗蟲活性測定

王珊珊 吳昊 李梁

（沈陽工學院 生命工程學院，撫順 113122）

花椒揮發油的提取及其抑菌抗蟲活性測定

王珊珊 吳昊 李梁

（沈陽工學院 生命工程學院，撫順 113122）

本實驗研究了不同溶劑對花椒揮發油的提取效果，進行了花椒揮發油對不同菌種的抑菌實驗，并探究了其對棉鈴蟲幼蟲的拒食性和忌避性。實驗結果表明：當乙醚作為提取劑時，提取率最高為8.77%；對不同菌種的抑菌效果無明顯差別；乙醚提取的花椒揮發油對棉鈴蟲幼蟲在拒食率及忌避率上均優于其他溶劑所提取的揮發油，對棉鈴蟲幼蟲有著更好的抑制力。

花椒揮發油；棉鈴蟲；拒食性；忌避性；抗菌活性

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），為蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木。原產地為中國，是中國特有的香辛料之一，果皮、種子、枝、葉均可入藥，其藥物功效在《神農本草經》和《本草綱目》中均有記載，并且在《中華人名共和國藥典》（2005版）中記載有“溫中止痛，殺蟲止癢”的功效［1-2］。衛生部于2002年確認了花椒為藥食兩用的原料。

花椒揮發油具有高度選擇性，在施藥條件下易于分解，無殘留，無污染，與環境和諧，對人畜安全，對天敵生物沒有毒性，且多數對害蟲有引誘、忌避、拒食和生長調節等作用［3，4］。花椒揮發油在抗炎、抑菌殺蟲、抗腫瘤等方面具有較強的藥理活性［5-6］。蔣小龍等［7］發現，花椒揮發油對玉米、稻谷等在倉儲過程中出現的害蟲以及儲糧中的曲霉和青霉具有一定的防治效果，因此，花椒在植物性殺蟲劑方面也有廣闊的開發前景。

棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，其幼蟲主要蛀食蕾、花、鈴，也取食棉花的嫩尖和嫩葉，形成孔洞和缺刻，造成無頭棉，影響棉花的正常發育［18］，使棉花產量降低，損害農民利益。本研究以期得到一種綠色環保的天然抗蟲劑，從而降低棉鈴蟲幼蟲對棉花的蛀食，減少棉花的蟲害，減少農民的損失。為花椒揮發油的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 花椒 市售干品四川大紅袍。

1.1.2 菌種及培養基 菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，酵母菌，黑曲霉，灰曲霉，米曲霉。培養基：細菌培養基為牛肉膏蛋白胨培養基；霉菌培養基為PDA培養基。

1.1.3 主要儀器及試劑 主要儀器有索氏提取器，圓底燒瓶，冷凝管，電熱套，恒溫水浴鍋，電子天平，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋。使用的試劑無水乙醇，甲醇，乙醚，石油醚，無水硫酸鈉均為分析純。

1.1.4 受試昆蟲 2-3齡棉鈴蟲幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 花椒揮發油的提取 采用索氏提取法［8］。將粉碎過的花椒粉末過20目篩后，稱取10 g于濾紙筒中，并將其置于安裝好的索氏提取器內，在圓底燒瓶內分別加入100 mL乙醚、石油醚、甲醇和無水乙醇這4種有機溶劑，并分別在45℃、65℃、70℃和85℃和各自回流4 h，收集提取液，再分別在34℃、60℃、64℃和78℃的水浴中揮干溶劑至恒重，得到揮發油。

1.2.2 得率計算與狀態觀察

花椒揮發油提取率=（M-M0）/10

其中，M（g）為揮發油連同容器重量；M0（g）為干燥容器重量。每次實驗樣品用量20 g。分別從顏色、氣味、狀態這3個方面對不同溶劑提取得到的揮發油進行感官評定并記錄結果。

1.2.3 菌懸液的制備 取活化的菌株，向無菌的試管中加人無菌生理鹽水，挑取1-2環大小適宜的菌群，制成濃度為105-106CFU/ml的菌懸液［9］。

1.2.4 抑菌實驗 采用牛津杯法［10-12］。配置培養基滅菌后倒入已滅菌的培養皿冷卻制成平板，將配置好的菌懸用無菌移液槍吸取200 μL后均勻涂布于培養基表面。將滅菌后的牛津杯置于已涂布有生長期受試菌種菌懸液的平板上，并向牛津杯中分別注入上一步實驗中的4種揮發油并用相應無機溶劑作對照，分別于溫箱中培養36 h后進行抑菌圈直徑的測量，進行3組平行實驗，求其平均值，單位mm。

1.2.5 拒食活性測定［13-15］采用小葉碟添加法。挑選生命力較強、大小均一的受試昆蟲20條，隔離于錐形瓶中保持其饑餓狀態5 h后，取出并將其置于潔凈的培養皿中；將采摘的新鮮樹葉裁剪成邊長為1 cm的正方形葉碟，將其浸泡于有機溶劑稀釋一倍的揮發油中1-2 s后取出，揮干溶劑后置于放有試蟲的培養皿內，對照組將葉碟浸于相應有機溶液中1-2 s，取出后揮干溶劑并按照實驗組操作。分別在6 h、12 h、18 h和24 h后觀察測量拒食面積并計算拒食率，進行3組平行實驗，求其平均值。公式如下：

拒食率（%）=［（對照組取食面積-處理組取食面積）/對照組取食面積］×100%

1.2.6 忌避活性測定［13，16］采用培養皿濾紙涂藥法。裁剪與培養皿直徑一致的圓形濾紙片，對折并在距離中線一毫米處將其剪成兩片類似半圓狀的濾紙片，其中一片用有機溶劑稀釋過一倍的花椒揮發油浸泡處理并揮干溶劑；另一片用相應有機溶劑浸泡處理并揮干溶劑進行對照，兩片濾紙片在互不接觸的情況下用透明膠固定于培養皿底部，備用。

在培養皿中放入等量試蟲，用濕潤紗布蓋好培養皿，在保證培養皿中氧氣充足的情況下放置觀察，并分別在3 h、6 h、9 h、12 h后觀察試蟲情況、計算忌避率，進行3組平行實驗，求其平均值。公式如下：

忌避率（%）=［（對照蟲數-處理蟲數）/對照蟲數］×100%

2 結果

2.1 不同溶劑提取花椒揮發油的得率與狀態觀察

分別選用4種不同的有機溶劑，按照1.2.1的方法進行提取并按照1.2.2的方法進行計算及狀態觀察。分別進行3次提取，求其平均值，平均提取率如圖1所示。乙醚作為提取劑的提取率最高為8.77%，無水乙醇次之為7.93%，石油醚作為提取劑的提取率最低為5.37%，可見當乙醚作為花椒揮發油的提取劑時，可最大限度將花椒中的揮發油提取出來。

圖1 四種溶劑對花椒揮發油提取率的比較

由表1可見，甲醇與乙醇的提取物性狀比較相似，均為深褐色，原因可能為兩種有機溶劑形狀相似，所提得揮發油組成成分亦比較相似，而乙醇提取揮發油成浸膏狀的原因可能為乙醇沸點相對較高，在提取和分離的過程中可能由于高溫而導致揮發油發生一定程度的氧化［17］，從而使其性狀發生改變；乙醚與石油醚提取揮發油的形狀相似，均為淡色透明液體。石油醚和無水乙醇的提取液在分離溶劑后仍留有輕微溶劑味，可能是提取過程中揮發油中部分組成成分與溶劑發生輕微反應導致。

表1 不同溶劑提取花椒揮發油的狀態觀察

2.2 抑菌活性比較

用牛津杯法，測定了4種不同的有機溶劑提取花椒揮發油的抑菌活性，其結果見表2。各種溶劑提取的花椒揮發油都對細菌有著一定的抑制作用，其中，相比較而言，以乙醚的提取液抑制效果最佳且對各類菌均有較明顯抑制效果，而抑制效果相對較差的為乙醇提取的揮發油。推測為乙醇提取的揮發油性狀不佳，流動性不好，無法更大范圍的抑制菌種生長。

表2 不同溶劑提取花椒揮發油的抑菌圈直徑（cm）

2.3 抗蟲活性比較

2.3.1 拒食活性測定 采用小葉碟添加法，測定了4種溶劑提得到的揮發油對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性。其結果見圖2。

圖2 不同溶劑提取的花椒揮發油對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性測定結果

由圖2可見，各溶劑提取的揮發油均對試蟲具有一定的拒食活性，而且效果較為明顯，不過隨著時間的推移，各實驗組的拒食活性均有不同程度的降低，這是由于花椒揮發油存在揮發性，隨著時間的增加揮發油濃度不斷降低，拒食活性也隨之減小。

2.3.2 忌避作用測定 采用培養皿濾紙涂藥法。不同溶劑提取花椒揮發油對棉鈴蟲的忌避作用結果見圖3至圖6。棉鈴蟲對乙醚提取揮發油的忌避性始終較高，但同時會隨著時間的推移有所下降（圖3），其原因推測為隨時間變化揮發油中的揮發性物質揮發掉，從而使其對昆蟲的驅逐性逐漸降低；棉鈴蟲對石油醚提取的花椒揮發油一開始忌避性很高，但隨著時間的不斷增加，忌避性下滑很快直至不明顯（圖4），由此可見石油醚提取出的花椒精油極易揮發，并可推測出其提取的揮發油成分不全；棉鈴蟲對甲醇提取的花椒揮發油忌避性始終適中，并無明顯下滑（圖5），由此可得出結論：甲醇提取的揮發油不易揮發，可較長久時間保存；棉鈴蟲對無水乙醇提取的花椒揮發油忌避性普遍偏低（圖6），結合揮發油性狀可得出結論，無水乙醇提取的揮發油可能隨乙醇的揮發加速花椒揮發油的揮發，使忌避率迅速下降。

綜上所述，石油醚提取花椒揮發油忌避率波動范圍最大，無水乙醇提取花椒精油其次，乙醚提取花椒精油忌避率波動范圍最小且忌避率普遍偏高。

圖3 棉鈴蟲對乙醚提取花椒揮發油忌避率測定結果

圖4 棉鈴蟲對石油醚提取花椒揮發油忌避率測定結果

圖5 棉鈴蟲對甲醇提取花椒揮發油忌避率測定結果

圖6 棉鈴蟲對無水乙醇提取花椒揮發油忌避率測定結果

3 討論

植物次生代謝物中對昆蟲有拒食性和忌避性的物質主要有萜烯類、生物堿和酚類等物質［19］。昆蟲的取食行為分為遠距離定位，近距離降落和接觸3個主要階段，是一個由多種化學感受器參與，受神經系統控制完成的生理行為。根據功能分類，化學感受器分為嗅覺感受器和味覺感受器，嗅覺感受器遠距離感知植物中揮發性的次生代謝物質，味覺感受器在與植物接觸后感知植物中的營養成分和取食抑制劑的種類和數量［20］。棉鈴蟲幼蟲的化學感受器對印楝素、肌醇和黑芥子苷敏感［21］。化學物質對昆蟲的拒食作用可能通過影響昆蟲口器上的感受器對營養物質的識別和刺激效應，進而引起昆蟲厭食［22］。

在抗蟲-拒食性和抗蟲-忌避性試驗中均出現受試昆蟲意外死亡的情況，除卻遭受意外碾壓，同族相殘等明確死亡方式外，還有少量試蟲死因不明。查閱資料后發現花椒揮發油對黏蟲幼蟲和楊毒蛾幼蟲均有一定程度的觸殺作用，及對小菜蛾幼蟲、黏蟲幼蟲、楊毒蛾幼蟲均具有極強的熏蒸毒殺作用［23］。在試驗過程中，雖已將對照組及實驗組的濾紙片進行溶劑揮干處理，但并無法確定是否有少量殘留，更無法確定該殘留對蟲體是否有類似“熏蒸性”的影響。因此并不排除花椒揮發油對其產生“觸殺性”及“熏蒸性”的可能，但由于這一現象并不常見且出現頻率不穩定，因此并未將“觸殺性”及“熏蒸性”列入實驗內容。

4 結論

本研究通過對不同有機溶劑索氏提取花椒揮發油得率比較試驗可知，乙醚提取花椒揮發油得率最高且性狀良好；不同溶劑提取花椒揮發油對不同菌種抑菌效果試驗可知，4種溶劑提取的花椒揮發油對不同菌種抑菌效果無明顯差別，對細菌普遍具有抑制性，但對霉菌的抑制性并不明顯；不同有機溶劑提取花椒揮發油對棉鈴蟲抗蟲性試驗可知，乙醚提取花椒精油首先在拒食率上高于其他溶劑所提取的揮發油，又在忌避率上穩定且微高于其他溶劑所提取的揮發油，由此可得出結論，乙醚提取花椒揮發油對棉鈴蟲幼蟲有著更好的抑制力。

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Extraction of Volatile Oil from Zanthoxylum and Determination of Its Antibacterial Activity and Insect Resistance

WANG Shan-shan WU Hao LI Liang
（Shenyang Institute of Technology，School of Life Engineering，Fushun 113122）

Extraction effects of volatile oil from Zanthoxylum by different solvents were studied，then the experiment of its antibacterial activity was conducted，and the antifeeding and repellency of cotton bollworms to volatile oil from Zanthoxylum were investigated. The results of the experiment were as follows，the best extraction rate was 8.77% while using ether as solvent，and there was no significant difference on antibacterial activity between strains. The extracted volatile oil from Zanthoxylum by ether showed priority on antifeeding and repellency of cotton bollworm larvae than those by other solvents，thus it should have better inhibitory effects on the larvae.

volatile oil；cotton bollworms；antifeeding；repellency；antibacterial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0412

2017-05-22

國家級大學生創新創業項目（201713201000003）

王珊珊，女，碩士研究生，研究方向：生化與微生物發酵；E-mail：shuihugai@163.com

（責任編輯 朱琳峰）