HPLC測定膽清片中虎杖苷的含量

游燕，牛延菲，張曉南，普冰清，和東陽，劉慧

HPLC測定膽清片中虎杖苷的含量

游燕，牛延菲，張曉南，普冰清，和東陽，劉慧

目的：建立高效液相色譜法測定膽清片中虎杖苷的含量，為該藥質量標準提高提供科學依據。方法：色譜柱采用Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈(80:20)；流速:1.0 mL﹒min-1，柱溫:30 ℃；檢驗波長為306 nm；進樣體積10 μL。結果：虎杖苷進樣量在0.0047 μg～2.3500 μg范圍內呈良好的線性關系(r=0.9998)，平均回收率為98.56%，RSD值為3.43%(n=9)。結論：HPLC法測定虎杖苷的含量簡單、準確，具有良好的重復性和穩定性，可作為膽清片中虎杖苷含量測定質量控制方法。

膽清片；虎杖苷；高效液相色譜法

膽清片(糖衣片)為云南白藥集團股份有限公司生產，由虎杖、竹葉柴胡、梔子、香附(醋炙)四味中藥材加工而成，有清化濕熱、疏肝利膽的作用，用于慢性膽囊炎肝膽濕熱證。其中虎杖為處方中君藥，是蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖及根，性寒、味苦，歸肝、膽、肺經[1]，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。虎杖苷是虎杖的特征成分，有較強的抗肝損傷能力，具有保肝利膽和抗菌的作用，主要用于治療膽石癥、膽囊炎、急慢性肝炎等病癥[2～6]。

現行標準中膽清片的含量測定是以紫外分光光度法測定大黃素含量，隨著藥品質量標準的要求提高，建立準確、穩定地測定膽清片中虎杖苷含量的方法就顯得非常有必要。本文采用HPLC法對膽清片中虎杖苷進行含量測定以及方法學驗證，旨在建立一種準確可行的測定虎杖苷含量分析方法，以期更好地控制產品質量。

1 實驗部分

1.1 儀器

美國Agilent高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國安捷倫科技有限公司)；超聲波清洗儀(SK3200 LH，上海科導超聲儀器有限公司)；電子天平(AG 285型，梅特勒-托利多公司)；純水機(Advantage A10，Milli-Q)；電熱恒溫水浴鍋(XMTD-4000，北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試藥

膽清片，由云南白藥集團股份有限公司提供，批號為040210、040728、050315、050824、070330、080425、080811、090108、101116、120109；膽清片缺少虎杖的陰性樣品由云南白藥集團股份有限公司提供。

虎杖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：111575-200502，純度99.9%)；所用流動相水為超純水，乙腈為色譜純，處理樣品的乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：水-乙腈(80:20)等度洗脫；柱溫：30℃；檢驗波長：306 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL﹒min-1。理論塔板數按虎杖苷計算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質峰均能達到基線分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取經五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含20 μg溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取膽清片10片，去除糖衣，精密稱定，研細，精密稱取約0.1 g，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。按上述供試品溶液處理方法制備陰性供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

按供試品溶液制備方法制備供試品溶液和缺虎杖的陰性供試品溶液，按上述項色譜條件，分別進樣對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液、空白溶液各10 μL。結果見圖1，由圖譜可以看出供試品溶液色譜中與對照品溶液色譜相應的位置上有相同的色譜峰出現，而陰性供試品溶液和空白溶液無此峰出現，表明處方中其他成分對成品中虎杖苷的含量測定無干擾。

圖1 虎杖苷HPLC圖

2.4 線性關系考察

精密稱取經五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品11.75 mg，置25 mL棕色容量瓶，加稀乙醇制成虎杖苷濃度為0.47 mg﹒mL-1的對照品儲備液，再逐級稀釋成濃度為235 μg﹒mL-1，94 μg﹒mL-1，47 μg﹒mL-1，23.5 μg﹒mL-1，9.4 μg﹒mL-1，4.7 μg﹒mL-1，2.35 μg﹒mL-1，0.94 μg﹒mL-1，0.47 μg﹒mL-1的系列對照品溶液，按上述項色譜條件測定。以虎杖苷吸收峰面積的積分值為縱坐標Y，進樣量(μg)為橫坐標X，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=3854.7X+6.2646，相關系數r=0.9998。結果表明，在上述色譜條件下，虎杖苷在0.0047 μg～2.3500 μg范圍內呈良好的線性關系，符合要求。

2.5 回收率試驗

精密稱取經五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品12.5 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。分別精密吸取上述對照品溶液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL各三份，共九份，自然揮干溶劑后，精密加入已知含量(0.59%)同一批號樣品約0.05 g，按供試品溶液制備方法制備，將處理好的供試品溶液按含量測定方法測定，結果見表1。試驗結果表明，該分析方法回收率在93.66%～101.46%之間，平均回收率為98.56%，RSD值為3.43%(n=9)，回收率良好。

表1 回收率試驗結果表

2.6 精密度試驗

2.6.1 方法精密度試驗 精密吸取虎杖苷對照品溶液(23.5 μg﹒mL-1)，按“2.1”項色譜條件，連續進樣6次，進樣量10 μL，記錄峰面積，RSD值為0.68%(n=6)，結果表明本法具有良好的方法精密度。

2.6.2 重復性試驗 精密稱取同一批號樣品(批號為：120109)6份，分別按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項色譜條件進樣，虎杖苷在樣品中的平均含量為0.59%，RSD值為1.72%(n=6)，結果表明本法具有良好的重復性。

2.6.3 中間精密度試驗 精密稱取同一批號樣品(批號為：120109)2份，由兩位分析人員在不同時間按照“2.2.2”項制備供試品溶液，使用不同高效液相色譜儀，按照“2.1”項色譜條件進樣，虎杖苷在樣品中的含量為0.58%，RSD值為1.0%(n=4)，結果表明本法具有良好的中間精密度。

2.7 穩定性試驗

取同一份樣品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別于0 h、4 h、6 h、12 h、24 h進樣，測定峰面積，虎杖苷峰面積RSD值為0.84%(n=5)，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 樣品測定

取10批樣品，按照“2.2.2”項制備供試品溶液，同時按上述“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中虎杖苷的含量，結果見表2。

表2 10批樣品虎杖苷測定結果表

3 討論

3.1 提取溶劑、提取方法選擇

根據虎杖的理化性質，本實驗參考2015版中國藥典一部虎杖項下虎杖苷的前處理(使用稀乙醇作為溶劑進行前處理)，同時結合膽清片的處方工藝(用70%乙醇回流提取)，選擇了稀乙醇和70%乙醇進行樣品前處理考察。結果表明，用稀乙醇作為提取溶媒，效果最好，故確定以稀乙醇作為提取溶劑。本實驗同時比較了超聲、回流兩種提取方法，結果表明回流提取方式比超聲提取方式含量較高，能將虎杖苷完全提取出來，故最終確定回流提取作為樣品前處理方法。

3.2 稱樣范圍的考察

本實驗選擇了不同的稱樣量進行回流提取，發現稱樣量在50%-150%范圍內含量基本相同，鑒于稱樣量為0.1 g時供試品溶液的峰面積較合理，故確定稱樣量為0.1 g。

3.3 限量確定

對10批樣品測定結果進行統計分析，本品每片含虎杖以虎杖苷計，剔除測定結果最高值(5.67 mg)及最低值(1.94 mg)，平均值為2.99 mg。按其平均值的70%確定含量限度，建議膽清片每片含虎杖以虎杖苷計為不少于2.0 mg。

4 結論

本文建立了HPLC法測定膽清片中虎杖苷的含量，此方法簡便、準確、重現性好、精密度高，陰性無干擾，可作為膽清片中虎杖苷含量測定的方法。該方法為膽清片質量標準提供了可靠依據，可以更好地指導生產，保證藥品質量。

[1] 中國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S](2015版).中國醫藥出版社,2015;208.

[2] 張海歡,繆紅.HPLC法測定疏風解毒膠囊中虎杖苷[J].中成藥,2013,35(10):2281.

[3] 富玉海，張立升.HPLC法測定清肝利膽膠囊中虎杖苷的含量[J].中國藥師,2007,10(2):147.

[4] 陳 剛.高效液相色譜法測定清肝利膽排石丸中虎杖苷含量[J].中國藥業,2015,24(1):46.

[5] 張紅,饒俊珍,程璐.高效液相色譜法測定前列回春丸中虎杖苷的含量[J].中國醫院用藥評價與分析,2015,15(8):1032.

[6] 郝立芳,袁曉芳.HPLC法測定金膽片中龍膽苦苷、虎杖苷含量[J].中國藥師,2011,3(9):1369.

Determination of polydatin in Danqing tablet by HPLC

/ YOU Yan, NIU Yan-fei ,ZHANG Xiao-nan, PU Bing-qing, HE Dong-yang, LIU Hui//(Yunnan Bai Yao Group Innovation and Ramp;D Center, Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, kunming 650111, Yunnan)

Objective:To establish a HPLC method for the determination of polydatin in Danqing tablet, and provide scientific basis for improving the quality standard of the drug.Method:Agilent ZORBAX SB C18column (4.6x250 mm, 5 μm) was used. Water-acetonitrile (80:20) was used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL﹒min-1. The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 306 nm and the injection volume was 10 μL.Result:The liner range of polydatin was in the range of 0.0047 μg～2.3500 μg (r=0.9998). The average recovery was 98.56% and the RSD was 3.43% (n=9).Conclusion:The method is simple, accurate with good reproducibility and stability, and can be used as a quality control method for the determination of polydatin in Danqing tablet.

Danqing tablet; polydatin; HPLC

282.6

A

1674-926X(2017)05-007-03

云南白藥集團創新研發中心, 云南省藥物研究所,云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室, 云南 昆明 650111，云南 昆明 650111

游燕，女，高級工程師，主要從事中藥分析 Email:yf_niu@126.com Tel:13577074553

2017-07-21

（責任編輯：李蕓霞）