熒光實時定量PCR研究GA負調控因子基因在棉花纖維不同發育時期的表達模式

易小平++謝翔++廖文彬

摘 要 棉花纖維發育經歷起始期、延伸期、次級細胞壁加厚期、脫水期共4個發育時期。為了了解GA負調控因子基因在整個纖維發育時期的調節作用，采用敏感的實時定量PCR對GA負調控因子基因GhRGL在棉花纖維不同發育時期中的轉錄水平進行了定量研究，通過提取來源于不同纖維發育階段[包括-3～0 DPA（開花后）胚珠，3 DPA胚珠，5 DPA胚珠，10 DPA胚珠，15 DPA纖維，25 DPA纖維]的樣品總RNA，探討不同發育時期GhRGL基因的表達模式。結果顯示，GhRGL基因在所有被選的樣品中都有表達，其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中轉錄水平較高， 在10 DPA胚珠中表達水平最高， 在-3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纖維、25 DPA纖維中的表達水平較低，表明GhRGL基因在纖維伸長期表達水平較高，暗示GhRGL可能對纖維伸長起著重要作用。

關鍵詞 熒光實時定量PCR ；棉花纖維發育 ；GA負調控因子基因 ；表達模式

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.009

Analysis of the Expression Pattern of GA Insensitive Regulator Gene

in Cotton Fiber Development by Realtime PCR

YI Xiaoping XIE Xiang LIAO Wenbin

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101）

Abstract Cotton fibers， which are highly elongated epidermal cells that grow from the seed integument， undergo a developmental process that includes cell fate determination， initiation， elongation， specialization， and finally， programmed cell death. Transcript levels of GhRGL at different stages of cotton fiber development were quantified and analyzed by sensitive and real-time PCR technique to understand the expression pattern of GhRGL gene at all stages of cotton fiber development. Total RNA samples were extracted from different stages of cotton ovules and fibers including -3～0 DPA ovules， 3 DPA ovules， 5 DPA ovules， 10 DPA ovules， 15 DPA fibers， and 25 DPA fibers to analyze the expression pattern of GhRGL gene in cotton fiber development. The results showed that the GhRGL gene was expressed in all selected cotton samples. Higher levels of GhRGL mRNA were detected in 5 DPA and 10 DPA ovules， and the highest levels of GhRGL mRNA were detected in 10 DPA ovules. Lower levels of mRNA were detected in -3～0 DPA ovules， 3 DPA ovules and 15 DPA fibers， and 25 DPA fibers. gene was expressed at the highest levels at the fiber elongation stage， suggesting the important role of GhRGL in cotton fiber elongation.

Keywords realtime PCR ； cotton fiber development ； GA insensitive regulator gene ； expression pattern

GA信號轉導途徑是通過DELLA蛋白來抑止的。所有的DELLA蛋白都具有以下特征：在N端有高度保守的DELLA結構域和VHYNP結構域[1-2]。在擬南芥基因組中，共有5個高度同源的DELLA蛋白抑止子，包括GA INSENSITIVE （GAI）、REPRESSOR OF ga1-3 （RGA）、RGL1 （RGA-LIKE 1）、RGL2、RGL3[2-3]。GAI和RGA在抑制植物延伸生長時具有重疊的功能，RGA-LIKE1 （RGL1）和RGL2分別在控制植物發芽和花發育中起著重要作用[4-5]。所有的DELLA蛋白均可以通過泛素降解系統進行降解，而不能對GA反應進行抑制[6-7]。

棉花纖維是生長于種子表面的高度延伸的表皮細胞，經歷了細胞命運決定期、起始期、延伸期、次級細胞壁加厚期，最終經脫水期后細胞程序死亡[8]。棉花纖維發育至少有一部分是由植物激素控制的[9]。通過胚珠液體體外培養對棉花纖維發育進行分析可知，外源IAA與GA是棉花纖維發育所必需的。筆者前期研究表明，使用GA生物合成抑制劑可抑制棉花纖維的生長，說明GA在啟動棉花纖維伸長中起著重要作用。 因此，在前期的研究中，對GA負調控因子基因DELLA基因進行分離研究，對分離的棉花DELLA蛋白進行生物信息學分析，結果顯示，該蛋白具有與擬南芥中DELLA蛋白一樣的保守結構域。本研究運用QPCR對DELLA蛋白編碼基因GhRGL在棉花纖維發育各個時期的表達模式進行了研究。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因來源

GA負調控因子基因GhRGL為本實驗室保存。

1.1.2 棉花胚珠來源

棉花胚珠來源于本實驗室基地。

1.1.3 儀器和試劑

StepOne Plus實時熒光定量PCR儀；熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green）；RNA提取試劑采用華越洋植物RNA試劑盒。反轉錄試劑盒SuperScript III Reverse Transcriptase購自美國Invitrogen公司；DNA消化酶、DNA Marker及實時定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司北京分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 棉花胚珠RNA提取

棉花RNA提取按Wan等[10]的方法進行。

1.2.2 反轉錄反應

取5 μL RNA模板進行逆轉錄反應，儀器為Biometra PCR儀。反應體系如下：5×逆轉錄buffer 2 μL，下游引物（25 μmol/L）0.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL （上海生工生物工程有限公司），MMLV（10×106 U/ L）1 μL，DEPC水0.5 μL，RNA模板5 μL，總體積為10 μL。反應條件：37 ℃反應1 h，然后95℃反應3 min。

1.2.3 引物及探針

GhRGL在棉花不同組織中的表達模式試驗：采用棉花的Histone3基因作為內對照基因，Ghhis3基因和GhRGL基因的定量PCR引物與探針通過網上程序ProbeFinder version （https：//www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/acenter.jsp？id=030000）

進行設計。Ghhis3基因定量PCR的引物：5′-TTCCAGAGGCTTGTTCGTG-3′（正向），5′-TTCCAGAGGCTTGTTCGTG-3′（反向）；探針：羅氏通用探針庫#61探針。GhRGL基因定量PCR的引物：5′-CAGCGGCGATGGGTATAG-3′（正向），5′-CTTGTATGCCACCCAAGCAT-3′（反向）；探針：羅氏通用探針庫#25探針。

1.2.4 定量PCR條件與定量方法

所有樣品總RNA采用RNase-free DNase I（TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd.， Dalian） 進行消化以排除基因組DNA的污染；所有樣品的cDNAs合成均采用PrimeSriptTM RT reagent Kit（TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd.， Dalian）；所有樣品的PCR反應均進行3次重復，并且設置了無模板與無反轉錄的對照；所有樣品的定量PCR分析均采用Stratagene Mx3000P QPCR System進行。定量RT-PCR的反應體系為25 μL，包括FastStart Universal Probe Master （ROX） （Roche Ltd.）12.5 μL ，hydrolysis probe 0.25 μL（25 μmol/L），正向引物（50 μmol/L）0.9 μL ， 反向引物（50 μmol/L）0.9 μL，ddH2O 9.45 μL，模板cDNA （5 ng/μL）2 μL。定量PCR的反應條件為：94℃ 10 min， 95℃ 15 s，60℃ 1 min，共進行40個循環。采用MxProTM QPCR Software Version 3.00（STRATAGENE）進行數據收集與分析。定量結果用循環閾值（CT）表示，樣品中基因相對表達量的確定參照前人的方法進行。不同樣品的CT值由公式ΔCT=CTtarget-CTcontrol計算得到，目標基因與內對照基因的表達差異用2-ΔCT公式確定，每一個樣品PCR反應重復3次，3次重復的2 -ΔCT 的平均值被用來確定目標基因與內對照基因的表達差異。

2 結果與分析

2.1 GhRGL基因和蛋白質序列

GhRGL基因序列見圖1，GhRGL基因推導出的蛋白質序列見圖2。

2.2 GhRGL基因聚類分析

通過序列比較發現，含有完整的GhRGL基因的核酸序列與AtGAI核酸序列的相似性為63.5%，棉花GhRGL蛋白序列與擬南芥中所有的DELLA蛋白（GAI， RGA， RGL1， RGL2 and RGL3）[1]具有高度的相似性，其氨基酸相似度分別為60.5%，59.8%， 63.1%， 61.8%，和58.1% （圖3）。DELLA蛋白編碼基因事實上屬于GRAS家族中的一員，DELLA 蛋白與GRAS家族的其它蛋白在C端具有高度的同源性，但在N端的同源性較差。然而，來源于不同植物的所有DELLA蛋白，在氨基酸序列的N端具有較高的同源性，包括高度保守的DELLA結構域和VHYNP結構域，以及一個多變的Poly S/T結構域。除此之外， 這些蛋白還具有多個保守的結構域，包括一個核定位信號（NLS）， 2個亮氨酸拉鏈motifs， 以及一個高度保守的GRAS結構域[3]。

2.3 棉花胚珠RNA提取

用于提取RNA的棉花樣品包括-3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、5 DPA胚珠、10 DPA胚珠、15 DPA纖維、25 DPA纖維共6個樣品，代表了棉花纖維發育的4個階段。提取的RNA經電泳檢測可知，其完整性好，結構如圖4所示。所有RNA樣品均用RNase-free DNase I進行處理以消化基因組DNA，反轉錄產物的第一鏈合成采用cDNA Synthesis Kit 進行合成。endprint

2.4 定量PCR標準曲線

采用相對定量的方法，對GA負調控因子基因GhRGL在棉花不同纖維發育階段的表達模式進行研究。采用Ghhis3（棉花組氨酸蛋白基因）作為對照基因，分別對GhRGL和Ghhis3基因進行標準曲線制作。分別將GhRGL和Ghhis3基因稀釋成6個梯度，取定量標準模板5 μL于不同的反應管中，在Stratagene Mx3000P QPCR System擴增儀上進行擴增。不同濃度標準的起始模板數具有不同的反應平臺期，因而有不同的Ct值，起始模板數與Ct值成正比例增長。因此，根據不同梯度的定量模板數與其對應Ct值的關系取對數擬合作圖，便得到定量標準曲線，將樣品與標準曲線進行比較，即可對樣品進行定量。由圖5可見，GhRGL基因的標準品Ct值與起始模板數之間呈線性關系，R=0.989，擴增效率為94.7%；Ghhis3基因的標準品Ct值與起始模板數之間呈線性關系，R=0.999，擴增效率為104.4%，線性關系極好，證實了用Ct值進行定量的準確性。

2.5 GhRGL基因在棉花纖維發育時期的表達模式分析

在棉花纖維發育過程中，胚珠的表皮細胞經歷幾個特殊而又重疊的步驟，包括纖維起始（-3～0 DPA）、伸長（5～15 DPA）、次級細胞壁合成（15～25 DPA）和成熟（25～45 DPA）， 最后形成成熟的纖維[8]。為了了解GhRGL基因在棉花整個纖維發育時期的表達模式，本研究采用敏感的實時PCR對GhRGL基因在棉花纖維不同發育時期的轉錄水平進行了定量研究，圖6是GhRGL基因與對照基因的擴增曲線。對來源于棉花不同纖維發育階段的胚珠樣品總RNA進行提取，6個來源于不同發育時期的樣品總RNA被用來分析GhRGL在棉花纖維中的表達模式，包括-3～0 DPA胚珠、 3 DPA胚珠、5 DPA胚珠、10 DPA胚珠、15 DPA纖維、25 DPA纖維。結果顯示，GhRGL基因在所有被選的樣品中都有表達，其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中有高的表達水平， 在10 DPA胚珠中的表達水平最高， 在 -3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纖維及25 DPA纖維中的表達水平較低（圖7）。由此可見，GhRGL基因在纖維伸長期表達水平高，暗示GhRGL可能對纖維伸長起著重要作用。

3 討論

GA信號轉導是通過DELLA蛋白來抑制的。通過Blast分析可知，本課題組前期從棉花組織中分離了一個DELLA蛋白編碼基因GhRGL。本研究利用定量PCR分析了該基因在棉花組織中的表達情況，結果表明GhRGL在纖維伸長階段具有高水平的表達，即GhRGL基因在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中高水平表達。據文獻報道，在擬南芥中，有5個DELLA蛋白，并且這5個DELLA蛋白編碼基因在擬南芥中具有不同的表達模式，RGA和GAI基因幾乎在所有組織中都有表達，而RGL1、RGL2、RGL3只在發芽的種子或花及莢中有高水平表達[11]。所有這些DELLA蛋白在擬南芥中具有不同的表達模式，表明不同的DELLA蛋白對擬南芥的發育具有不同的調節作用。與擬南芥中的DELLA蛋白類似，在棉花中，可能具有7個不同的DELLA蛋白編碼基因（4個RGL2s， 2個GAIs和一個RGL1）[12]。與擬南芥中的DELLA 蛋白類似，棉花中不同的DELLA可能也具有不同的功能，以調節棉花的生長與發育。

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