利用半肝切除再生模型研究單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)耐藥鴨乙型肝炎病毒DNA的動(dòng)態(tài)變化

沈國俊， 江小云， 黃 潔， 曾小冬， 毛龍火， 付喜花

(1 九江市第三人民醫(yī)院 肝病中心， 江西 九江 332000； 2 番禺區(qū)中心醫(yī)院 感染科， 廣州 511400)

利用半肝切除再生模型研究單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)耐藥鴨乙型肝炎病毒DNA的動(dòng)態(tài)變化

沈國俊1， 江小云1， 黃 潔1， 曾小冬1， 毛龍火1， 付喜花2

(1 九江市第三人民醫(yī)院 肝病中心， 江西 九江 332000； 2 番禺區(qū)中心醫(yī)院 感染科， 廣州 511400)

目的利用半肝切除再生模型研究單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)耐藥鴨乙型肝炎病毒(DHBV)DNA的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。方法45日齡慢性DHBV感染鴨半肝切除后接種突變株轉(zhuǎn)染上清，持續(xù)飼喂拉米夫定，定期采血及取肝組織標(biāo)本，檢測(cè)外周血病毒DNA水平及病毒株，流式細(xì)胞儀分選單個(gè)肝細(xì)胞核及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性與陰性細(xì)胞核，巢式PCR擴(kuò)增核內(nèi)DHBV YMDD區(qū)，直接測(cè)序法檢測(cè)是否存在突變。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法。半肝切除前后PCNA的比較使用方差分析Welch法。結(jié)果半肝切除前單個(gè)核內(nèi)病毒DNA及血清中克隆均為野生株；接種突變株轉(zhuǎn)染上清后，在半肝切除術(shù)后1周時(shí)突變株感染的肝細(xì)胞核比率高于術(shù)后12周時(shí)的水平 (χ2=7.225,P<0.01)；術(shù)前PCNA陽性肝細(xì)胞核比率為(0.84±0.36)%，術(shù)后1周時(shí)顯著升至(42.26±6.48)%，術(shù)后12周時(shí)為(11.83±3.97)%，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=190.832，P<0.001)；術(shù)后1周時(shí)突變株感染的PCNA陽性細(xì)胞核比率高于術(shù)后12周時(shí)的水平，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.063,P<0.01)， 而術(shù)后PCNA陰性的細(xì)胞核突變株感染的比率極低。結(jié)論半肝切除可為耐藥病毒提供復(fù)制空間，但耐藥病毒在外周血及肝內(nèi)未能形成優(yōu)勢(shì)毒株。

肝炎病毒, 乙型, 鴨； 抗藥性, 病毒； 半肝切除； 肝再生

由于慢性鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染時(shí)肝內(nèi)傳播空間(DHBV未感染的肝細(xì)胞數(shù)量)的限制，耐藥 DHBV 感染的肝細(xì)胞數(shù)量極低以致核內(nèi)耐藥的病毒DNA檢測(cè)不到[1]；但半肝切除后肝細(xì)胞快速再生可給耐藥病毒提供傳播空間[2]。本研究擬用鴨乙型肝炎慢性感染動(dòng)物模型，先給予拉米夫定抑制體內(nèi)的野生株病毒復(fù)制，并行半肝切除術(shù)觀察肝細(xì)胞是否再生活躍；術(shù)后接種DHBV耐藥株，檢測(cè)血清與單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)病毒株的變化，了解游離耐藥突變株能否感染新生肝細(xì)胞，能否在肝內(nèi)快速傳播成為優(yōu)勢(shì)株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器 45日齡慢性DHBV感染鴨(廣州市白云區(qū)龍歸鎮(zhèn)孵化場(chǎng))[3]，血清DNA提取試劑盒(德國QIAGEN)，固定破膜劑(美國invitrogen公司)，鼠抗人PCNA單克隆抗體(美國eBioscience公司)，流式PCNA二抗(羊抗鼠IgG，美國BD公司)，PE標(biāo)記(美國invitrogen公司)。羅氏Lightcycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國BECTON DICKINSON公司FACSAriaTM流式細(xì)胞分選系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、半肝切除術(shù)和病毒接種 將8只45日齡慢性DHBV感染鴨分為2組：治療組5只，每只動(dòng)物持續(xù)飼喂拉米夫定(20 mg·kg-1·d-1)，每周采血1次；當(dāng)血清DHBV DNA連續(xù)2次低于real-time PCR檢測(cè)下限(3 log10拷貝/ml)時(shí)，行肝右葉半肝切除術(shù)；在維持抗病毒治療下，分別于肝切后48 h和72 h靜脈接種DHBV突變株轉(zhuǎn)染上清各1 ml[4](real-time PCR定量DHBV DNA為8.16×107拷貝)；術(shù)后繼續(xù)給藥12周，術(shù)后1周肝活組織檢查及采血，術(shù)后4周及8周采血，術(shù)后12周采血處死所有動(dòng)物，取出肝組織。未治療組3只，行半肝切除并接種突變株轉(zhuǎn)染上清，標(biāo)本采集流程同治療組。

1.3 血清DHBV DNA定量及病毒株的檢測(cè) 血清DHBV DNA的提取詳見試劑盒說明書，熒光定量 PCR的檢測(cè)具體方法詳見參考文獻(xiàn)[3]。巢式PCR擴(kuò)增血清DHBV DNA YMDD區(qū)段，引物由上海英駿生物公司合成(表1)；巢式PCR擴(kuò)增第1輪反應(yīng)體系為20 μl (ddH2O 4.5 μl, 2×Buffer 10 μl, dNTPs 2 μl, PS1 0.2 μl, PS2 0.2 μl, KOD酶0.3 μl, 模板3 μl)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，30 s后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。巢式PCR擴(kuò)增第2輪反應(yīng)體系為50 μl (ddH2O 37 μl, 10×Buffer 5 μl, dNTPs 4 μl, DMF2 0.5 μl, DMR2 0.5 μl, Blend-taq 0.5 μl, 模板3 μl)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min， 30 s后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后凝膠回收；將擴(kuò)增回收目的片段連接T載體，進(jìn)行TA克隆的構(gòu)建；再進(jìn)行轉(zhuǎn)化、鋪板，挑取并PCR篩選陽性克隆；1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物陽性菌液送華大基因公司測(cè)序。

表1 DHBV DNA YMDD區(qū)段巢式PCR引物序列

1.4 肝細(xì)胞核的分離 稱取10 mg凍存肝組織置入高壓滅菌后的2 ml柱形玻璃研磨器中，加入1 ml勻漿液[終濃度為：10 mmol Tris HCl (pH 7.5), 3 mmol MgCl2, 0.25 mol Sucrose, 0.05%Triton X-100]。通過勻漿研磨處理，直至組織完全溶解 (研磨約10～15次)，將研磨后的組織勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中；低速離心收集細(xì)胞核 (2000 r/min，5 min)，棄上清；加入1 ml勻漿液重懸細(xì)胞核沉淀團(tuán)低速離心 (2000 r/min，5 min)，棄上清；再次加入1 ml勻漿液重懸細(xì)胞核沉淀團(tuán)低速離心 (2000 r/min，5 min)[5]。

1.5 肝細(xì)胞核PCNA的標(biāo)記及流式分選 每份肝細(xì)胞核懸液準(zhǔn)備2個(gè)5 ml流式管，分別加入PBS稀釋100 ml(細(xì)胞核數(shù)約1×106)，1管為同型對(duì)照、1管為PCNA標(biāo)記。每個(gè)流式管中加入100 μl破膜A液，避光15 min后加入2 ml PBS洗滌2次，再加入100 μl破膜B液，另標(biāo)記管中加入2 ml鼠抗人PCNA一抗，避光20 min；每管再加入2 ml PBS洗滌2次，然后加入100 μl PBS，其中標(biāo)記管加入PE標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗5 μl，同型對(duì)照管加入6 μl PE標(biāo)記的同型抗體，避光20 min；所有管均加入2 ml PBS洗滌后再加入300 μl PBS均勻混合。通過設(shè)定對(duì)應(yīng)的PE熒光標(biāo)志，先載入同型對(duì)照管，再放入標(biāo)記檢測(cè)管，調(diào)整閾值，在PE散點(diǎn)圖中，對(duì)PCNA陽性及陰性肝細(xì)胞核2個(gè)亞群細(xì)胞依次設(shè)門，應(yīng)用全自動(dòng)細(xì)胞分選系統(tǒng)設(shè)置分選參數(shù)，分選無標(biāo)記、PCNA標(biāo)記陽性及PCNA標(biāo)記陰性3類單個(gè)肝細(xì)胞核至每孔加有12 μl消化液[終濃度為:10 mmol Tris HCl (pH 7.5)，0.1%Triton X-100，200 μg/ml蛋白酶K]的96孔板中。顯微鏡下確認(rèn)每個(gè)孔內(nèi)僅有1個(gè)細(xì)胞核[5]。

1.6 單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV DNA的YMDD區(qū)擴(kuò)增和測(cè)序 分選后的96孔板于50 ℃溫浴60 min，使蛋白酶K充分消化核膜，DNA從單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)釋放出來，再經(jīng)75 ℃、15 min滅活蛋白酶K；每孔再加入5個(gè)單位的EcoR Ⅰ，37 ℃酶切4～5 h，使cccDNA酶切成雙鏈線性DNA，便于PCR擴(kuò)增[5]。將處理后樣品進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增單個(gè)核內(nèi)DHBV YMDD區(qū)，反應(yīng)體系及條件同上述。將第2輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，根據(jù)結(jié)果選取陽性樣品送華大基因公司測(cè)序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)條件者采用Fisher精確概率法。半肝切除前后PCNA表達(dá)的比較采用方差分析Welch法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血DHBV DNA水平的變化 慢性DHBV感染鴨外周血DHBV DNA平均水平為(7.17±0.53)log10拷貝/ml。治療組持續(xù)口服拉米夫定16～22周，血清DHBV DNA水平低于3 log10拷貝/ml(檢測(cè)下限)；行半肝切除并接種突變株轉(zhuǎn)染上清，術(shù)后1周時(shí)所有動(dòng)物外周血病毒水平升高至(4.43±0.68)log10拷貝/ml，而在術(shù)后4、8和12周逐漸下降，并在第12周達(dá)最低水平，出現(xiàn)術(shù)后一過性反彈。而未治療組動(dòng)物整體維持高病毒血癥狀態(tài)(圖1)。

圖1半肝切除后接種突變株病毒外周血DHBV DNA水平的變化

2.2 血清中耐藥突變株的比例變化 篩選2只治療組動(dòng)物(3號(hào)和23號(hào))不同時(shí)間點(diǎn)血清中的陽性病毒株克隆各15個(gè)，直接測(cè)序法檢測(cè)YMDD區(qū)段。結(jié)果顯示半肝切除前血清中克隆均為野生株，接種突變株轉(zhuǎn)染上清后，在術(shù)后1、4、8、12周，3號(hào)動(dòng)物分別檢測(cè)到6(40%)、3(20%)、1(6.7%)、1(6.7%)個(gè)突變株，23號(hào)動(dòng)物分別檢測(cè)到7(46.7%)、4(26.7%)、2(13.3%)、0個(gè)突變株(圖2)。結(jié)果提示野生株始終為DHBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢(shì)株，隨接種時(shí)間的延長，突變株在血清中的比例降低，并未成為優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種。

圖2 半肝切除后血清中耐藥突變株的比例變化 a：3號(hào)動(dòng)物；b：23號(hào)動(dòng)物

2.3 突變株感染的肝細(xì)胞核比例變化 流式分選各時(shí)間點(diǎn)肝組織標(biāo)本的單個(gè)細(xì)胞核，巢氏PCR擴(kuò)增單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA的YMDD區(qū)。基線時(shí)(肝右葉半肝切除術(shù)時(shí))每只動(dòng)物分別獲取30個(gè)，術(shù)后1周及12周每只動(dòng)物各獲取90個(gè)陽性PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。結(jié)果顯示治療組在接種突變株轉(zhuǎn)染上清前所有動(dòng)物單個(gè)核內(nèi)DHBV均為野生株；術(shù)后1周時(shí)所有動(dòng)物均有少量的肝細(xì)胞核感染了突變株(1.1%～7.8%)，高于術(shù)后12周時(shí)感染突變株的比率(0～4.4%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.225，P<0.01)(表2)。未治療組動(dòng)物3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)突變株。

表2 半肝切除后突變株感染的單個(gè)肝細(xì)胞核比例的變化[例(%)]

2.4 PCNA表達(dá)陽性肝細(xì)胞核比例變化 PCNA染色單個(gè)肝細(xì)胞核懸液后，經(jīng)流式分選儀分選，結(jié)果顯示基線時(shí)PCNA陽性肝細(xì)胞比率極低(0.84±0.36)%，提示正常肝細(xì)胞穩(wěn)定很少再生；術(shù)后1周時(shí)比率顯著升高(42.26±6.48)%，有近一半的肝細(xì)胞增殖；但在術(shù)后12周時(shí)比率顯著降低(11.83±3.97)%。各時(shí)間點(diǎn)PCNA表達(dá)陽性肝細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=190.832，P<0.001)(表3)。

表3 半肝切除后PCNA陽性的肝細(xì)胞核比例變化(%)

2.5 突變株感染的不同標(biāo)記的肝細(xì)胞核比例變化 采用巢氏PCR擴(kuò)增治療組動(dòng)物術(shù)后PCNA標(biāo)記陽性及陰性的單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA的YMDD區(qū)，每只動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)分別獲取30個(gè)陽性PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。結(jié)果顯示所有動(dòng)物在術(shù)后1周時(shí)有少量PCNA陽性肝細(xì)核能檢測(cè)到突變株(6.7%～16.7%)，而術(shù)后12周時(shí)有3只動(dòng)物極少部分PCNA陽性細(xì)胞核感染了突變株(0～6.7%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.063,P<0.01)；在PCNA陰性的細(xì)胞核中，術(shù)后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)各1只動(dòng)物僅有1個(gè)細(xì)胞核檢測(cè)到突變株(表4)。

表4 突變株感染的PCNA陽性及陰性單個(gè)肝細(xì)胞核比例的變化[例(%)]

3 討論

核苷類藥耐藥突變是逆轉(zhuǎn)錄過程中隨機(jī)發(fā)生的結(jié)果。在藥物治療與宿主免疫反應(yīng)的選擇壓力下，耐藥突變株在肝臟內(nèi)大量復(fù)制并逐漸轉(zhuǎn)為優(yōu)勢(shì)株[6]。cccDNA庫中野毒株轉(zhuǎn)為耐藥突變株的效率與肝細(xì)胞再生速度密切相關(guān)[7]。目前有關(guān)cccDNA的檢測(cè)仍存有爭(zhēng)議，但研究證實(shí)核內(nèi)病毒 DNA主要是以cccDNA的形式存在，能較直接反映cccDNA水平及狀態(tài)[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，鴨半肝切除后，流式標(biāo)記法檢測(cè)肝組織PCNA的表達(dá)均較術(shù)前顯著增多。PCNA是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，存在并合成于核內(nèi)，其含量和表達(dá)強(qiáng)弱的變化與DNA合成及DNA復(fù)制的活躍程度一致，多用于反映細(xì)胞增殖程度和評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的狀態(tài)[8]。鴨半肝切除后，肝細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的再生能力，有大量新生肝細(xì)胞生成以恢復(fù)肝細(xì)胞數(shù)量和肝臟結(jié)構(gòu)。本研究報(bào)道與兔和大鼠的肝再生模型[9]結(jié)論一致，下一步將采取免疫組化法進(jìn)一步證實(shí)本結(jié)論。

基線時(shí)血清及單個(gè)核內(nèi)病毒DNA均為野生株。半肝切除后，在肝細(xì)胞增殖活躍期接種耐藥株病毒上清，血清中與單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)均檢測(cè)到少量DHBV M512V突變株的存在，但未能成為優(yōu)勢(shì)株。以往研究證實(shí)慢性感染狀態(tài)下，幾乎每個(gè)肝細(xì)胞都感染了HBV，由于cccDNA半衰期與被感染肝細(xì)胞壽命較長，未感染的肝細(xì)胞數(shù)量較少。此外由于HBV感染肝細(xì)胞時(shí)存在重復(fù)感染排除現(xiàn)象，認(rèn)為耐藥突變株無法再感染野生株已感染的肝細(xì)胞，導(dǎo)致耐藥病毒再感染肝細(xì)胞的機(jī)會(huì)很低[1]。這種重復(fù)感染排除現(xiàn)象使肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV毒株只有1種，而核內(nèi)病毒形式主要為cccDNA和少量的rcDNA，因此可以推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中肝細(xì)胞核內(nèi)存在DHBV耐藥株cccDNA。HBV耐藥株是缺陷病毒，其復(fù)制活性低于HBV野生株，在同野生株的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，藥物的選擇壓力是耐藥產(chǎn)生的必要條件[10]。用野生株感染鴨中耐藥M512V突變株不能自發(fā)產(chǎn)生，需要2年以上抗病毒治療才會(huì)出現(xiàn)[1]，并逐漸替代野生株成為優(yōu)勢(shì)株，因此可推測(cè)在半肝切術(shù)后1、12周時(shí)肝細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)的突變株為接種的游離DHBV突變株感染引起。本研究結(jié)果表明，核內(nèi)耐藥DHBV DNA感染肝細(xì)胞核數(shù)量并未隨著拉米夫定治療時(shí)間的延長而增加，而是逐漸減少，即觀察時(shí)間內(nèi)耐藥毒株在肝內(nèi)未能成為優(yōu)勢(shì)株。

本研究還發(fā)現(xiàn)耐藥突變株主要感染新生的肝細(xì)胞。對(duì)于慢性DHBV感染鴨，即使野生型DHBV的復(fù)制已被核苷類似物充分抑制，但親代肝細(xì)胞仍然存在DHBV cccDNA[11]，因此半肝切除能否為耐藥DHBV肝臟內(nèi)傳播提供足夠的空間還取決于cccDNA從親代肝細(xì)胞分配到子代肝細(xì)胞的幾率。由于新生未感染的肝細(xì)胞較少，肝內(nèi)病毒感染主要以野生株為主，突變株難以快速大量感染肝細(xì)胞，形成優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種。

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引證本文：SHEN GJ, JIANG XY, HUANG J, et al. Dynamic changes in drug-resistant duck hepatitis B virus DNA in single hepatocyte nucleus after hemihepatectomy using a liver regeneration model[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(11): 2127-2131. (in Chinese)

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(本文編輯：劉曉紅)

Dynamicchangesindrug-resistantduckhepatitisBvirusDNAinsinglehepatocytenucleusafterhemihepatectomyusingaliverregenerationmodel

SHENGuojun,JIANGXiaoyun,HUANGJie,etal.

(LiverDiseaseCenter,ThirdPeople′sHospitalofJiujiangCity,Jiujiang,Jiangxi332000,China)

ObjectiveTo investigate the dynamic changes in drug-resistant duck hepatitis B virus (DHBV) DNA in single hepatocyte nucleus after hemihepatectomy using a liver regeneration model.MethodsDucks aged 45 days with chronic DHBV infection were inoculated with mutant DHBV after hemihepatectomy and then fed with lamivudine. Blood samples and liver tissue samples were collected at regular intervals. Viral DNA level in peripheral blood and viral strains were measured. Flow cytometry was used to isolate single hepatocyte nuclei and nuclei with or without proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Nested-PCR was used for the multiplication of intranuclear DHBV YMDD region. Direct sequencing was used to determine the absence or presence of mutation. The chi-square test and the Fisher′s exact text were used for comparison of categorical data between groups. The Welch method was used for comparison of PCNA before and after hemihepatectomy.ResultsThere were wild strains in single hepatocyte nuclei and serum before hemihepatectomy. After inoculation with mutant strains, the percentage of hepatocyte nuclei infected with mutant strains decreased significantly from 1 week to 12 weeks after hemihepatectomy (χ2=7.225,P<0.01). The percentage of PCNA-positive hepatocyte nuclei was 0.84%±0.36% before surgery, significantly increased to 42.26%±6.48% at 1 week after surgery, and was 11.83%±3.97% at 12 weeks after surgery, and there was a significant difference between different time points (F=190.832,P<0.001). The percentage of PCNA-positive nuclei infected with mutant strains decreased significantly from 1 week to 12 weeks after surgery (χ2=7.063,P<0.01), while the percentage of PCNA-negative nuclei infected with mutant stains was extremely low after surgery.ConclusionHemihepatectomy may provide a replication space for drug-resistant virus, but drug-resistant virus cannot become dominant strains in the peripheral blood and the liver.

hepatitis B virus, duck; drug resistance, viral； single hepatocyte nuclei; liver regeneration

R512.62

A

1001-5256(2017)11-2127-05

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.015

2017-05-03；

2017-06-05。

江西省青年科學(xué)基金計(jì)劃(20142BAB215038)

沈國俊(1983-)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事病毒性肝炎基礎(chǔ)與臨床研究。

付喜花，電子信箱：xihuafu2008@126.com。