高效液相色譜法測定益之康膠囊中總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)的含量

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(1.浙江工業大學化學工程學院,浙江杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052)

高效液相色譜法測定益之康膠囊中總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)的含量

壽林均1,程巧鴛2,黃柳倩1,周明昊1,2,*

(1.浙江工業大學化學工程學院,浙江杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052)

建立益之康膠囊中總蒽醌含量測定的高效液相色譜法。采用HPLC測定益之康膠囊中2種蒽醌類成分大黃素和大黃素甲醚的含量;流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25,v/v),柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,檢測波長254 nm。大黃素和大黃素甲醚分別在0.054～0.65 μg和0.022～0.27 μg范圍內呈良好的線性關系,相關系數分別為0.9999和0.9999,檢出限分別為0.86 μg/g和0.87 μg/g,平均回收率分別為97.20%(RSD=2.26%)和99.96%(RSD=2.18%)。結論:該方法簡便、準確、可靠。

益之康膠囊,大黃素,大黃素甲醚,總蒽醌,高效液相色譜法(HPLC)

益之康膠囊是以丹參、制何首烏、山楂、澤瀉、玉竹為主要原料,經提取,輔以淀粉,經制粒、混合、填充膠囊等工藝制成的保健食品,具有調節血脂的功能。其中制何首烏為寥科植物何首烏PolygonummultijiorumThunb.的干燥塊根經燉法或蒸法炮制而成。性味苦、甘、澀,微溫,歸肝、心、腎經。具有補肝腎,益精血,烏須發,強筋骨,化濁降脂的功效,用于血虛萎黃,眩暈耳鳴,須發早白,腰膝酸軟,肢體麻木,崩漏帶下,高脂血癥[1]。現代藥理研究表明,何首烏提取物及其有效部位具有調節血脂、抗動脈粥樣硬化等作用[2-3]。何首烏的主要化學成分有五大類:二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類、磷脂類和多糖類[4],其中蒽醌類化合物主要包括游離蒽醌(游離型大黃素和大黃素甲醚)及其與葡萄糖形成的結合蒽醌,而結合蒽醌是何首烏導致瀉下作用的主要成分[5]。何首烏經炮制成制何首烏后,結合蒽醌水解成無瀉下作用的游離蒽醌,從而降低毒性,減小副作用[6],但炮制不當或不徹底仍會使結合蒽醌含量偏高[7],長期使用易產生腹瀉作用。國家食品藥品監督管理總局(國食藥監許[2010]2號)要求以何首烏等含蒽醌類成分為原料的保健食品,在產品質量標準中應增加蒽醌類成分的含量檢測指標,并按照范圍值標示。目前,蒽醌類成分的含量測定方法主要為紫外分光光度法[8-9]和高效液相色譜法[10-19]。紫外分光光度法雖然操作簡單,但其干擾大,影響因素多,并且顯色不穩定,所以實際難以準確測定總蒽醌的含量。

本文參考中國藥典2015年版制何首烏項下蒽醌類成分的含量測定方法以及朱培芳[10],蔡麗芬[12],徐乾麗[16],戴作波[17],胡建華[19]等的研究成果,以大黃素和大黃素甲醚對照品為對照,采用高效液相色譜法測定益之康膠囊中總蒽醌的含量,制何首烏中總蒽醌有游離型和結合型兩種,結合型的蒽醌主要與苷元結合存在,需要將其水解成游離型蒽醌,并以原游離型蒽醌和結合型蒽醌水解而成的游離型蒽醌的含量來計算益之康膠囊中總蒽醌的含量。本文用HPLC法測定益之康膠囊中總蒽醌的含量,操作簡便,結果可靠,為益之康膠囊的質量控制提供了一種新手段。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

對照品大黃素(110756-201512,含量測定用,純度98.7%,使用前不需干燥)和大黃素甲醚(110758-201415,含量測定用,純度99.1%,使用前無需處理) 均由中國食品藥品檢定研究院提供,色譜純的甲醇和乙腈 默克公司;分析純的三氯甲烷 南京化學試劑股份有限公司;優級純的鹽酸和分析純的磷酸 國藥集團化學試劑有限公司;益之康膠囊 由正大青春寶藥業有限公司提供,批號分別為研究用樣、1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008。

Agilent1260型高效液相色譜儀(G1311B 1260 Quat Pump,G1367E 1260 Hip ALS,G1316A 1260 TCC,G1314F 1260 VWD);紫外檢測器Agilent色譜工作站。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Waters Sunfire C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長:254 nm;流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.2 對照品溶液制備 大黃素對照品溶液:取大黃素對照品約20 mg,精密稱定,用甲醇溶解,定容到50 mL,即得。大黃素甲醚對照品溶液:取大黃素甲醚對照品約20 mg,精密稱定,先用少量三氯甲烷溶解,然后用甲醇定容到250 mL,即得。分別精密吸取0.4327 mg/mL的大黃素對照品溶液5 mL和0.0884 mg/mL的大黃素甲醚對照品溶液10 mL,混合后用甲醇稀釋并定容到20 mL,即得混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 取本品內容物適量,研細,取約2.000 g,精密稱定,置回流瓶中,精密加入8%鹽酸溶液25 mL和三氯甲烷25 mL,水浴中加熱回流1 h,取出,立即冷卻,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,洗液并入分液漏斗中,分取三氯甲烷液,酸液再用三氯甲烷振搖提取3次(30、20、20 mL),合并三氯甲烷液,回收溶劑至干,殘渣加甲醇使溶解,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

1.2.4 檢出限 將同一批供試品溶液稀釋成一系列濃度的溶液,以取樣量為2.000 g,信噪比約為3時計算檢出限。

1.2.5 線性關系考察 精密吸取1.2.2中大黃素和大黃素甲醚的混合對照品溶液0.5、1、2、4、6 μL,按照1.2.1中的色譜條件注入高效液相色譜儀中,記錄大黃素、大黃素甲醚的峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標、峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,標準曲線用Y=aX+b表示。

1.2.6 精密度實驗 精密吸取1.2.2中大黃素和大黃素甲醚的混合對照品溶液10 μL,按照1.2.1中的色譜條件注入高效液相色譜儀中且連續進樣六次,計算峰面積的RSD。

1.2.7 溶液穩定性實驗 精密吸取1.2.3中的供試品(研究用樣)溶液10 μL,按照1.2.1中的色譜條件于1、2、4、6、10、12、18、24 h后進樣,計算峰面積的RSD。

1.2.8 重復性實驗 分別稱取同一批供試品(研究用樣)6份,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進樣測定并計算RSD。

1.2.9 專屬性實驗 取沒有制何首烏的陰性樣品,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進樣測定。

1.2.10 回收率實驗 取供試品(1604003)適量,研細,取約2.0 g,精密稱定,置回流瓶中,按低、中、高三個水平精密加入混合對照品溶液(平行三份),按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進樣測定,計算回收率和RSD。

1.2.11 樣品測定 按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進樣,分別測定了廠家提供的6批樣品(批號分別為1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008)。

1.2.12 計算 大黃素和大黃素甲醚的含量按式(1)計算:

式(1)

注：A-大黃素(或大黃素甲醚)的峰面積;b-大黃素(或大黃素甲醚)線性方程的截距;a-大黃素(或大黃素甲醚)線性方程的斜率;V1-進樣體積(μL);V2-稀釋倍數(mL);m-供試品稱樣質量(g)。

總蒽醌的含量按式(2)計算:

總蒽醌含量(mg/g)=大黃素的含量+大黃素甲醚的含量

式(2)

所有計算都在Microsoft Excel 2016中完成。

2 結果與分析

2.1檢出限

以供試品溶液信噪比約為3時計算得大黃素和大黃素甲醚的檢出限分別為0.86 μg/g和0.87 μg/g。

表2 精密度實驗結果Table 2 Precision results of the proposed HPLC method

表3 穩定性實驗結果Table 3 Stability results of the proposed HPLC method

2.2線性關系考察

如表1所示,大黃素和大黃素甲醚在0.054～0.65 μg和0.022～0.2700 μg范圍內呈現良好的線性關系,相關系數分別為0.9999和0.9999。

2.3精密度實驗

如表2所示,大黃素和大黃素甲醚的RSD分別為0.08%和0.10%,表示儀器精密度良好。

2.4溶液穩定性實驗

如表3所示,大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌在24 h內的RSD分別為1.85%、3.47%和2.04%,表示溶液在24 h內穩定。

2.5重復性實驗

如表4所示,供試品(研究用樣)測得大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌的平均含量分別為0.1369、0.0181、0.1549 mg/g,RSD分別為1.37%、1.56%和1.21%,表明方法的重復性良好。

2.6專屬性實驗

取沒有制何首烏的陰性樣品,按1.2.3中供試品溶液制備法制備,按照1.2.1中的色譜條件進樣測定,結果在大黃素和大黃素甲醚對照品峰處未出現色譜峰,說明按上述方法測定,陰性樣品無干擾,見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of emodin and physcion 注;A:混標色譜圖,B:樣品色譜圖, C:缺制何首烏的樣品色譜圖。

2.7回收率實驗

如表5所示,大黃素的加標平均回收率為97.20%,RSD為2.26%,大黃素甲醚為99.96%,RSD為2.18%。

表4 重復性實驗結果Table 4 Repeatability results of the proposed HPLC method

表5 回收率實驗結果Table 5 Average spike recoveries and RSDs for emodin and physcion

2.8樣品測定

1604001、1604002、1604003、1505001、1108002、20151008樣品中的大黃素、大黃素甲醚和總蒽醌的含量如表6所示,本實驗中的蒽醌主要來自配方中的制何首烏,2015版中國藥典中規定制何首烏中游離蒽醌以大黃素和大黃素甲醚的總量計,并且含量不得少于0.10%,本實驗測的總蒽醌包括游離蒽醌和結合蒽醌兩部分,目前暫無國標要求。

表6 樣品測定結果Table 6 The results of samples

表7 前處理優化結果Table 7 The results of preprocessing optimization

2.9前處理優化

采用(1)8%(質量分數)鹽酸,三氯甲烷(2)16%(質量分數)鹽酸,三氯甲烷來水解結合型蒽醌并提取總蒽醌,結果如表7所示。實驗證明8%鹽酸,三氯甲烷法的總蒽醌含量最高,其潛在原因可能是大黃素甲醚極性較弱,在甲醇中的溶解性較低,而其在益之康膠囊中含量又不高,故提取效率不高,同時三氯甲烷極性較弱,根據相似相溶原理可知,大黃素甲醚能溶于三氯甲烷,雖然其在益之康膠囊中含量不高,但經過三氯甲烷多次萃取,基本能將游離型蒽醌中的大黃素甲醚提取完全。

2.10流動相的比較

本實驗曾對不同流動相(1)乙腈-0.1%磷酸溶液(60∶40)、(2)甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)、(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)的色譜行為進行了比較。在(2)甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)中,大黃素未完全分離,前峰腳位置包含未知物質;在(1)乙腈-0.1%磷酸溶液(60∶40)和(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)中,大黃素和大黃素甲醚能完全分離,但在(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)中,大黃素和大黃素甲醚附近干擾較少,同時甲醇的成本比乙腈低廉,所以選擇(3)甲醇-0.1%磷酸溶液(75∶25)作為流動相。

圖2 不同流動相的色譜圖Fig.2 Chromatograms of different mobile phase

2.11柱溫的比較

本實驗比較了不同柱溫30、35、40 ℃對樣品分離的影響,結果隨著柱溫升高出峰時間加快,如圖3所示,在30 ℃時峰形較好。

圖3 不同柱溫的色譜圖Fig.3 Chromatograms of different temperature

3 結論

益之康膠囊中的總蒽醌(大黃素和大黃素甲醚)主要來自于配方中的制何首烏,通過8%(質量分數)的鹽酸水解結合型蒽醌后經三氯甲烷多次萃取,能較好的提取出大黃素和大黃素甲醚,并用高效液相色譜測定大黃素和大黃素甲醚的含量,將大黃素和大黃素甲醚的含量之和作為總蒽醌的含量。經過方法學驗證,說明該方法簡便、準確、可靠:大黃素和大黃素甲醚分別在0.05409～0.6491 μg和0.02211～0.2653 μg范圍內呈良好的線性關系,相關系數分別為0.9999和0.9999,平均回收率分別為97.20%(RSD=2.26%)和99.96%(RSD=2.18%)。同時,由于大黃素甲醚微溶于甲醇,應先用少量三氯甲烷溶解后再用甲醇定容。

[1]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:175.

[2]王春英,張蘭桐,袁志芳,等.何首烏醋酸乙酯提取部位與二苯乙烯苷的調血脂作用[J].中草藥,2008,39(1):78-83.

[3]顧慧,呂圭源,陳素紅,等. 何首烏“補肝腎、益精血、強筋骨”功效相關的藥理研究[J].世界科學技術-中醫現代化,2008,10(2):58-62.

[4]樓招歡,呂圭源,俞靜靜.何首烏成分、藥理及毒副作用相關的研究進展[J].浙江中醫藥大學學報,2014,38(4):495-500.

[5]梅雪,余劉勤,陳小云,等.何首烏化學成分和藥理作用的研究進展[J].藥物評價研究,2016,39(1):122-131.

[6]史國兵.炮制對何首烏中有效成分含量的影響[J].中國醫院藥學雜志,2003,23(2):95-97.

[7]施群,施淑琴.炮制對何首烏總蒽醌含量的變化研究[J].中華中醫藥學刊,2012,30(12):2770-2772.

[8]劉云娣,李得堂,任結梅,等.紫外分光光度法測定大承氣沖劑中大黃總蒽醌的含量[J].中醫藥導報,2010,16(7):108-110.

[9]王玉寶. 紫外分光光度法測定決明子中蒽醌類成分含量[J].中醫藥臨床雜志,2013,25(8):730-732.

[10]朱培芳,趙榮華,施揚憲. HPLC法同時測定何首烏中二苯乙烯苷和5種蒽醌類化合物的方法[J].中華中醫藥雜志,2012,27(2):463-465.

[11]付衛華. HPLC法測定何首烏炮制過程中主要化學成分含量[J].亞太傳統醫藥,2013,9(7):50-51.

[12]蔡麗芬,鐘國躍,張倩,等. HPLC測定不同生長年限及采收期何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量[J]. 中國中藥雜志,2010,35(10):1221-1225.

[13]史輯,劉梓晗,王玲,等.HPLC測定不同產地巴戟天中5種茜草素型蒽醌的含量[J].中藥材,2015,38(2):245-248.

[14]李櫻紅,汪瑾,胡磊,等. HPLC測定紅曲黃酮片中總蒽醌的含量[J].中國現代應用藥學,2012,29(12):1131-1133,1139.

[15]吳迪,袁海銘,曾憲儀,等.HPLC法測定大黃總蒽醌膠囊5種蒽醌苷元及5種游離蒽醌含量[J]. 江西中醫藥大學學報,2016,28(1):68-70.

[16]徐乾麗,茅向軍,熊慧林. HPLC法測定六味安消膠囊中游離蒽醌、總蒽醌和結合蒽醌的含量[J]. 貴陽醫學院學報,2010,35(6):578-580,583.

[17]戴作波,張建霞. HPLC法測定自制降脂膠囊中大黃蒽醌衍生物的含量[J]. 臨床合理用藥,2016,9(2A):95-96.

[18]韓燕全,洪燕,謝道俊,等. HPLC法同時測定黃蒲通竅膠囊中3種蒽醌類成分的總含量[J]. 云南中醫中藥雜志,2011,32(2):56-58.

[19]胡建華,陳文芝,徐超群,等. HPLC梯度洗脫測定痔康泰納米粒中大黃蒽醌成分的總含量[J]. 華西藥學雜志,2009,24(3):288-290.

[20]袁琦,楊潔,趙輝,等.HPLC測定一清膠囊中的5種大黃蒽醌衍生物[J]. 華西藥學雜志,2014,29(4):430-432.

Determinationoftotalanthraquinone(emodinandphyscion)inYizhikangcapsulebyhighperformanceliquidchromatography

SHOULin-jun1,CHENGQiao-yuan2,HUANGLiu-qian1,ZHOUMing-hao1,2,*

(1.Zhejiang University of Technology,College of Chemical Engineering,Hangzhou 310014,China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

Objective:To establish a High Performance Liquid Chromatography(HPLC)method for determining the totalanthraquinone in Yizhikang capsule. Methods:The contents of emodin and physcion were determined by a HPLC method. The emodin and physcion were separated on a Waters Sunfire C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)using a mobile phase made up of methanol and 0.1% phosphoric acid solution(75∶25,v/v)at a flow rate of 1.0 mL/min and detected by a UV detector at a wavelength of 254 nm.The column temperature was set at 30 ℃.Results:The response showed good linear relationship in the range of 54.09～649.05 μg/mL for emodin,22.11～265.31 μg/mL for physcion with all the coefficients of correlation(R2)=0.9999.The detection limits(LODs)were 0.86 μg/g for emodin,0.87 μg/g for physcion,respectively. The average recoveries of emodin and physcion were 97.20%(RSD=2.26%)and 99.96%(RSD=2.18%),respectively. Conclusions:This method is simple,accurate,reliable and reproducible and can be used for the quality control of yizhikang capsule.

Yizhikang capsule;emodin;physcion;total anthraquinone;high performance liquid chromatography(HPLC)

2017-03-03

壽林均(1993-)，男，碩士，研究方向：保健食品及化妝品的檢測，E-mail：1837393007@qq.com。

*

周明昊(1971-)，男，碩士，主任藥師，研究方向：保健食品及化妝品的檢測，E-mail：zmh888@hotmail.com。

TS207.3

A

1002-0306(2017)21-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.050