超聲-微波協(xié)同提取廬山石耳多糖條件優(yōu)化及其功能活性研究

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(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000; 2.九江市區(qū)域產(chǎn)業(yè)與城市生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西九江 332000)

超聲-微波協(xié)同提取廬山石耳多糖條件優(yōu)化及其功能活性研究

張紅芳1,吳次虎1,陳曄1,2,*

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000; 2.九江市區(qū)域產(chǎn)業(yè)與城市生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西九江 332000)

為探索超聲波-微波輔助提取廬山石耳多糖的工藝及其功能活性。以超聲-微波協(xié)同提取方法,分別考察微波功率、超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間、料液比對廬山石耳多糖得率的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過L9(33)正交實(shí)驗(yàn),對廬山石耳多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,廬山石耳多糖最佳提取工藝:微波功率為150 W、料液比為1∶30 (g∶mL)、超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間為240 s,廬山石耳多糖得率為12.87%;通過測定清除DPPH·對廬山石耳多糖的體外抗氧化活性評價(jià)。結(jié)果表明,廬山石耳多糖具有較高的體外抗氧化活性,濃度為 65 μg/mL時(shí)對DPPH·的清除率為65.62%;利用MTT法分析廬山石耳多糖對HepG2細(xì)胞體外生長增殖的抑制作用,結(jié)果顯示:廬山石耳多糖對HepG2細(xì)胞的抑制作用明顯,廬山石耳多糖濃度在0.001～2 mg/mL范圍內(nèi),對HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)出急劇上升,當(dāng)廬山石耳多糖濃度為10 mg/mL時(shí)抑制率為87.79%,IC50值為0. 6637 mg/mL。

超聲-微波協(xié)同提取,廬山石耳多糖,工藝優(yōu)化,抗氧化,抗腫瘤

廬山石耳(Umbilicariaesculenta)為石耳科(Umbilicariaceae)石耳屬(Umbilicaria)地衣植物,又稱美味石耳,是東亞特有種[1-2]。石耳即可食用又可藥用,全草入藥,具有清熱解毒、止咳祛痰、平喘消炎等多種功能。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析,石耳營養(yǎng)價(jià)值極高,富含有石耳多糖、肝糖、膠質(zhì)、石耳酸、鐵、磷、鈣及多種維生素,是一種高蛋白滋陰潤肺之補(bǔ)品[3]。

近年來,研究表明地衣中所含的地衣多糖均具有抗腫瘤及免疫活性。地衣多糖的抗腫瘤活性是通過增強(qiáng)健康細(xì)胞的免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞的病態(tài)增殖,因而克服了在化療中健康細(xì)胞受損的嚴(yán)重副作用[2-3]。石耳作為一種地衣資源,在探索其多糖生物學(xué)活性基礎(chǔ)上,對其食藥用價(jià)值進(jìn)行合理評價(jià)和開發(fā)利用,將具有較大的社會和經(jīng)濟(jì)效益[4-5]。

目前,對石耳多糖提取方法主要有索氏萃取、復(fù)合酶法輔助萃取等方法,索氏萃取石耳中多糖的提取率為4.63%～15.07%,而提取時(shí)間長[7-10],復(fù)合酶法輔助提取石耳中多糖的提取率為 1O.52%,而復(fù)合酶法提取多糖需要 1 h,需要多種酶復(fù)合[11]。而有關(guān)超聲波-微波輔助萃取廬山石耳多糖工藝鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以水為溶劑,廬山石耳多糖得率為指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)法對超聲波-微波輔助提取廬山石耳多糖工藝條件進(jìn)行了優(yōu)選并且進(jìn)行了功能活性的研究,為廬山石耳的進(jìn)一步開發(fā)利用及其多糖的生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

廬山石耳(U.esculenta) 于2015年5月采集江西廬山(采集后洗凈,經(jīng)干燥、粉碎、過60目篩后,備用);齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海如吉生物科技公司;維生素C對照品 德國巴斯夫公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[1,1-diphenyl-2-picryylhydrazyl(DPPH)]南京奧多福尼生物科技有限公司;HepG-2細(xì)胞 中國科學(xué)院生物化學(xué)研究所;Sevage試劑[氯仿(V)∶正丁醇(V)=4∶1];3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Sigma-Aldrich公司;RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA 基諾生物技術(shù)公司;胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司。葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、正丁醇、30%過氧化氫、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純。

CW-2000 型超聲-微波協(xié)同萃取儀 新拓分析儀器科技有限公司;U-3310紫外-可見分光光度計(jì) 島津;BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;TDL-40B低速臺式大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;AE31倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;BioTek酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廬山石耳多糖的提取工藝流程 稱取2.00 g廬山石耳粉末,按一定的料液比加入蒸餾水,采用超聲波-微波輔助的方法提取廬山石耳多糖,以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,保留上清液,再加入3倍體積的95%冰乙醇,放入冰箱過夜。次日以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心15 min,離心得到的沉淀即為廬山石耳的粗多糖,采用Sevag法除去粗多糖中的蛋白質(zhì)[7]。

1.2.2 廬山石耳多糖檢測方法 采用苯酚-硫酸法測定樣品中的多糖。準(zhǔn)確稱取10 mg經(jīng)烘干的葡萄糖,用蒸餾水溶解并定容至100 mL(濃度為100 μg/mL)。分別吸取上述溶液0、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL加入試管中,每管用蒸餾水定容至2 mL,配制成系列標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,各管加1.0 mL 6% 苯酚溶液,再加入濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,30 ℃水浴15 min,于490 nm處測定各管OD值,得到葡萄糖含量x與吸光度y的回歸方程。

將脫蛋白后的廬山石耳多糖用去離子水溶解定容至100 mL,搖勻,從中移取1 mL于10 mL容量瓶,加去離子水至刻度。取樣液2.0 mL于10 mL具塞試管中,加入6% 苯酚溶液1.0 mL,再加入濃硫酸5.0 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同的方法進(jìn)行多糖測定,按下式計(jì)算樣品中石耳多糖的得率。

式中:w為提取到的廬山石耳多糖質(zhì)量/g;W為石耳質(zhì)量/g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在50 W/40 kHz超聲波的條件下,固定微波功率150 W,料液比1∶20 g/mL,考察不同提取時(shí)間120、180、240、300、360、420 s對廬山石耳多糖得率的影響;固定提取時(shí)間180 s,料液比1∶20,考察不同微波功率100、150、200、250、300 W對廬山石耳多糖得率的影響;固定提取時(shí)間180 s,微波功率150 W,考察不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL對廬山石耳多糖得率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過L9(33)正交表設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),從而得出廬山石耳多糖提取的最優(yōu)工藝條件。因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The levels and factors of orthogonal test

1.2.5 抗氧化實(shí)驗(yàn) 采用Mohsen法[11]對廬山石耳多糖提取物的抗氧化活性進(jìn)行測定。量取樣品溶液1 mL于試管中,并加入0.1 mmol/L的DPPH· 甲醇溶液3.0 mL,充分混勻,室溫避光靜置30 min后于517 nm處測定其吸光值;以維生素C(VC)作陽性對照。DPPH· 清除率(%)=[A對照-(A樣品-A空白)]/A對照×100。

1.2.6 廬山石耳多糖抗腫瘤活性測定 利用MTT法分析廬山石耳多糖對HepG2細(xì)胞體外生長增殖的抑制作用進(jìn)行測定。將廬山石耳多糖配制成:0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10的濃度(mg/mL),進(jìn)行對數(shù)生長期HepG-2細(xì)胞抑制作用觀察和測定,以細(xì)胞空白和溶劑空白為對照,計(jì)算不同濃度下的細(xì)胞抑制率[12]。上述實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔,每組重復(fù)3次。

式中:D1為實(shí)驗(yàn)組吸光度;D2為細(xì)胞空白組吸光度;D0為溶劑空白組吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波功率對廬山石耳多糖得率的影響 由圖1得知,在開啟50 W/40 KHz超聲波的條件下,隨著微波功率的上升,廬山石耳多糖得率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢,當(dāng)微波功率為150 W時(shí),廬山石耳的多糖得率達(dá)到最大值。當(dāng)微波功率為 150～300 W時(shí),廬山石耳多糖的得率隨著功率的上升而降低。當(dāng)微波功率在某一范圍內(nèi),微波功率的增加使得廬山石耳多糖與提取劑之間相互作用頻率增加,這有利于廬山石耳多糖的浸提,但當(dāng)微波功率超過某一范圍時(shí),由于機(jī)械振動(dòng)過于劇烈,反而導(dǎo)致多糖的穩(wěn)定性下降,促進(jìn)多糖的分解,進(jìn)而導(dǎo)致多糖的提取下降[13]。因此,150 W為最佳的微波功率。

圖1 微波功率對廬山石耳多糖得率的影響Fig.1 Effect of micro-wave power on the yield of Polysaccharide from U. esculenta

2.1.2 料液比對廬山石耳多糖得率的影響 由圖2得知,料液比的變化對廬山石耳多糖得率的影響較大。隨溶劑體積的增加,廬山石耳多糖得率增加,當(dāng)料液比為1∶20 g/mL,廬山石耳多糖的得率達(dá)到最大值,當(dāng)溶劑體積再增加時(shí),廬山石耳多糖的得率相對比較穩(wěn)定,這是因?yàn)槿軇┰黾拥揭欢恐?多糖大都被浸提出來,即使再增加溶劑用量,廬山石耳多糖的得率相對穩(wěn)定。溶劑用量的增加會增加后續(xù)工作的工作量,不經(jīng)濟(jì)。因此,篩選1∶20 g/mL為最適宜的料液比。

圖2 料液比對廬山石耳多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides from U. esculenta

2.1.3 超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間對廬山石耳多糖得率的影響 固定微波功率和料液比等因素,考察不同提取時(shí)間對廬山石耳多糖得率的影響。由圖3得知,當(dāng)提取時(shí)間為180 s時(shí),廬山石耳多糖得率達(dá)到最大值。之后,隨著提取時(shí)間的遞增,廬山石耳多糖的得率下降。可能是在一定的時(shí)間范圍內(nèi),提取時(shí)間增加有利于多糖的浸提。但當(dāng)提取時(shí)間超過某一范圍時(shí),多糖的得率降低,這可能是由于在長時(shí)間的超聲細(xì)胞破碎中,多糖受到超聲波機(jī)械剪切作用的影響,部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞,造成得率下降,另外長時(shí)間作用雜質(zhì)溶出,這也是多糖得率下降的原因[13]。因此,180 s為最佳的提取時(shí)間。

圖3 超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間對廬山石耳多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from U. esculenta

2.2正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)對廬山石耳多糖超聲波-微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析結(jié)果見表2、表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test

由表2的極差分析與廬山石耳多糖得率的關(guān)系結(jié)果可知,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),各因素對廬山石耳多糖得率的影響為微波功率>料液比>提取時(shí)間。各因素對廬山石耳多糖提取效果影響的方差分析結(jié)果見表3。根據(jù)F值可知,對廬山石耳多糖得率影響因素從大到小依次為微波功率>料液比>提取時(shí)間,與極差分析結(jié)果一致,因此,通過正交實(shí)驗(yàn)可以優(yōu)選出廬山石耳多糖的最適宜提取工藝條件為正交優(yōu)化條件為A2B3C3,即超聲波-微波輔助提取廬山石耳多糖的最佳工藝參數(shù)為:微波功率150 W,提取時(shí)間240 s,料液比1∶30 (g∶mL)。按正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),得到廬山石耳多糖得率分別為12.87%、12.84%、12.91%,平均值為12.87%±0.03%。結(jié)果表明,在上述工藝條件下廬山石耳多糖得率相對比較穩(wěn)定,達(dá)到了優(yōu)化的目的。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.3廬山石耳多糖的功能活性

2.3.1 廬山石耳多糖的抗氧化活性 由圖4可知,廬山石耳多糖濃度在10.0～65 μg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著廬山石耳多糖濃度的增大而對DPPH· 清除率增強(qiáng),當(dāng)廬山石耳多糖濃度為65 μg/mL時(shí),清除率達(dá)最大值為65.62%,之后隨廬山石耳多糖濃度增加,對DPPH· 清除效果基本穩(wěn)定。從圖5中可知,維生素C在濃度為 9 μg/mL的條件下即可對DPPH·表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力,維生素C濃度在16～18 μg/mL范圍清除率隨維生素C濃度的增加清除率下降。總之,廬山石耳多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力,但其對DPPH· 清除效果要小于維生素C作用效果,這可能是提取石耳多糖為粗多糖含有較多其它化合物,從而影響對DPPH· 的清除效果。

圖4 廬山石耳多糖對DPPH·的清除效果Fig.4 DPPH·scavenging activity of polysaccharides of U.esculenta

圖5 維生素C對DPPH·的清除效果Fig.5 DPPH·scavenging activity of VC

2.3.2 廬山石耳多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖 利用MTT法分析廬山石耳中多糖對Hep G2細(xì)胞體外生長增殖的抑制作用,結(jié)果顯示:廬山石耳中粗多糖對Hep G2細(xì)胞體外增殖抑制作用明顯。由圖6可知,石耳多糖濃度為 0.001 mg/mL時(shí),對7.54%的腫瘤細(xì)胞有抑制能力,隨著石耳多糖濃度的上升,腫瘤細(xì)胞的存活率迅速下降,計(jì)算IC50值為0. 6637 mg/mL,當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),對腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到87.79%。王慧等利用MTT法分析黑石耳、紅石耳等2種石耳多糖對Hep G2細(xì)胞體外生長增殖的抑制作用,結(jié)果顯示:黑石耳粗多糖濃度為10 μg/mL對Hep G2細(xì)胞的抑制作用為8. 11%(IC50=0. 2567 mg/mL),而紅石耳粗多糖濃度為10 μg/mL對Hep G2 細(xì)胞沒有抑制作用,只有高濃度的條件下才有抑制作用[14]。可見,廬山石耳多糖對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)抑制作用。

圖6 廬山石耳多糖對HepG-2細(xì)胞抑制率的影響Fig.6 HepG-2control rate of polysaccharides of U. esculenta

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲-微波輔助提取廬山石耳多糖的工藝,最佳提取工藝為:微波功率為150 W、料液比為1∶30 (g∶mL)、超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間為240 s。廬山石耳多糖得率為12.87%。王衛(wèi)東[8]等對石耳多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行了研究,結(jié)果為提取溫度80 ℃,提取時(shí)間4 h,料液比1∶10 (g∶mL),在此工藝條件下,水溶性石耳多糖的得率為4.63%。古麗扎爾·阿布都克依木等[9]從網(wǎng)脊石耳(U.decussate)和淡膚根石耳(U.virginis)提取了多糖,經(jīng)蒽酮-硫酸顯色,波長615 nm處測定其多糖含量分別為網(wǎng)脊石耳為13.71%,淡膚根石耳為11.52%,并對淡膚根石耳多糖類成分提取工藝進(jìn)行了研究,得出最佳提取工藝為:乙醇濃度95%,提取溫度80 ℃,料液比1∶20 (g∶mL),提取時(shí)間3.0 h,在最佳條件下多糖的得率為 15.07%[10],雖然該方法提取多糖得率較高,但提取時(shí)間長。可見,本實(shí)驗(yàn)采用超聲-微波輔助提取多糖具有提取時(shí)間短、簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好、得率較高等特點(diǎn)。為今后廬山石耳多糖成分研究提供有用的參考價(jià)值。

石耳多糖是一類具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抗凝血及免疫促進(jìn)等生物活性作用的生物大分子,關(guān)于石耳多糖活性的研究已成為熱點(diǎn)。王慧等對紅石耳不同溶劑提取物的抗氧化活性及其粗多糖的抗腫瘤活性進(jìn)行了評估,結(jié)果顯示:紅石耳不同溶劑提取物具有很好抗氧化活性和抗腫瘤活性[12];姚玉飛等對黃山石耳多糖的提取及其抗氧化性研究表明,黃山石耳多糖具有較高的體外抗氧化活性[14];丁東寧等對黑石耳多糖對羥自由基的消除作用發(fā)現(xiàn)黑石耳多糖具有較好抗氧化作用[15]。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)廬山石耳中石耳多糖具有較強(qiáng)抗氧化和抗腫瘤活性,但其抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚無定論,有關(guān)免疫活性的機(jī)理也需進(jìn)一步的探索。

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StudyonthefunctionalactivityandoptimizationofultrasonicmicrowaveassistedextractiontechnologyofpolysaccharidesfromUmbilicariaesculenta

ZHANGHong-fang1，WUCi-hu1，CHENYe1,2，*

(1.College of Life Science,JiuJiang University,Jiujiang 332000,China; 2.Jiujiang Key Laboratory of Regional Industry and Urban Ecology,Jiujiang 332000,China)

To explore the ultrasonic microwave assisted extraction technology and the functional activity of polysaccharides fromUmbilicariaesculenta. The ultrasonic microwave synergistic extraction method was used,and the effects of microwave power,extraction time and the ratio of material to liquid have been investigated on the extraction rate of polysaccharides fromU.esculenta. On the basis of single factor experiment,the extraction technology of polysaccharides fromU.esculentawas optimized by L9(33)orthogonal experiment. The results showed that the optimum extraction process of polysaccharides fromU.esculentaas follows:the micro-wave power was 150 W,the ratio of material to liquid was 1∶30 (g∶mL),and the ultrasonic micro-wave synergistic extraction time was 240 s. The extracted polysaccharides were 12.87%.Invitroantioxidant activity of polysaccharides fromU.esculentawas studied by the scavenging activities of DPPH free radical. The results showed that the polysaccharides had higher antioxidant activityinvitro,and the scavenging rate of DPPH free radical was 65.62% at the concentration of 65 μg/mL.MTT method was used to analyze the inhibitory effect of polysaccharides fromU.esculentaon proliferation of HepG2 cellsinvitro. The results showed that the inhibitory effect of polysaccharides on HepG2 cells was obvious. In the range of 0.001～2 mg/mL,the inhibition rate of HepG2 cells showed a sharp rise. As the concentration of polysaccharides was 10 mg/mL,the inhibition rate was 87.79%. And the IC50value was 0.6637 mg/mL.

ultrasonic microwave assisted extraction;polysaccharides fromU.esculenta;technology optimization;antioxidant;antitumor

2017-05-02

張紅芳(1971-)，女，碩士，講師，研究方向：植物資源開發(fā)利用，E-mail：939044612@qq.com。

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陳曄(1966-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源開發(fā)利用，E-mail：chenyejjtc@126.com。

TS201.1

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1002-0306(2017)21-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.045