清咽潤喉雙華李涼果的研制及功效評價

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(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

清咽潤喉雙華李涼果的研制及功效評價

宋倩,周愛梅*,王爽,胡燕敏,方瓊謎,李雪娜,林春秀

(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

本文以雙華李果胚為原料,采用響應面優化四種中草藥(金銀花、甘草、胖大海、薄荷)提取濃縮液的復配比,結合涼果傳統加工工藝研發一種具有清咽潤喉功效的雙華李涼果,以脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞為模型,通過對炎癥因子(TNF-α、IL-lβ、IL-6、PGE2、NO)分泌的影響評價其清咽潤喉效果。結果表明,四種中草藥提取濃縮液的最佳復配濃度分別為:金銀花56 mg/mL、甘草59 mg/mL、胖大海61 mg/mL、薄荷105 mg/mL。在炎癥反應中,一定濃度的樣品均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低(p<0.05),而對PGE2的分泌沒有顯著性影響(p>0.05);當濃度達到為50 mg/L時的抑制抑制作用最強,對TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,說明研制的雙華李涼果能夠抑制炎癥因子的分泌,具有清咽潤喉功效。

雙華李,涼果,中草藥提取液,脂多糖,抑制炎癥

涼果是以果蔬等為主要原料,經腌制、漂洗、糖(蜜)熬煮或浸漬,添加或不添加食品添加劑和其他輔料,經晾曬(烘干)等干燥處理加工而成的干態或半干態制品[1]。廣式涼果深受消費者喜愛[2],而雙華李含有大量的礦物質、維生素、有機酸等,營養成分種類非常豐富,是制作廣式涼果的主要生產原料之一[3]。近年來,具有一定保健功能的新型涼果成為研究熱點[4-6],而日趨嚴重的環境污染使越來越多的人患有咽喉病[7],因此清咽潤喉功能性涼果的研究具有積極意義。而傳統的清咽潤喉涼果類產品,如黃皮[8]、李子等,功效并不顯著,且產品經糖漬后會極大掩蓋原料的固有功效。

因此本實驗以雙華李果為原料,添加國家食品藥品監督管理局(SFDA)批準的具有清咽潤喉功能的金銀花、甘草、胖大海、薄荷提取液,研發一種具有清咽潤喉功效的雙華李涼果,并采用RAW264.7巨噬細胞模型評價其對炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、PGE2、NO分泌的影響,一方面可以豐富涼果市場,另一方面又可以豐富保健食品市場,為消費者提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

硫藏雙華李果胚、金銀花、甘草根、胖大海、薄荷 廣東展翠食品有限公司提供;金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌 廣東省微生物菌種保藏中心;RAW264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫;亞硝酸鈉、二甲基亞砜、DMEM培養基、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胎牛血清、二甲亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素 由Sigma公司提供;Mouse TNF-α、IL-1β、IL-6、PEG2ELISA試劑盒 南京建成公司;檸檬酸 市售分析純;糖 市售食品級白糖。

EZ-SX500N質構儀 島津企業管理(中國)有限公司;EnSpire酶標儀 PerkinElmer公司;LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SWCJ-A超凈工作臺 上海浦東榮豐科學儀器有限公司;LRH系列生化培養箱 上海一恒科技有限公司;恒溫水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 雙華李涼果的制備 雙華李涼果的制作工藝流程:硫藏雙華李果胚→脫鹽→脫硫→硬化→扎孔→第一次滲糖→第二次滲糖→第三次滲糖→第四次滲糖→干燥→成品(關鍵控制點為脫硫、滲糖、干燥)[10]。

清洗:選用飽滿、大小均一的硫藏雙華李果胚,清洗干凈。

脫鹽:將果胚在清水(自來水)中浸泡20 h進行脫鹽。

脫硫:將果胚置于4%的檸檬酸液中于90 ℃下燙漂15 min[11](質量比1∶5)。

硬化:將果胚置于硬化液(0.5% NaCl、0.2%檸檬酸、0.5%CaCl)中進行硬化5 h(質量比3∶1)。

第一次滲糖:將四種中草藥(金銀花、甘草、胖大海、薄荷)提取濃縮液(100 mg/mL)、蔗糖、甜味劑與水混合得到糖液(金銀花,56 mg/mL;甘草,59 mg/mL;胖大海,61 mg/mL;薄荷,105 mg/mL;蔗糖濃度,15%;甜菊糖,0.15 g/kg,其中中草藥濃度為滲糖溶液中最終質量濃度),將糖液與果胚(質量比3∶1)一起于90 ℃下加熱煮制,進行第一次滲糖,煮至糖液濃度約為20%左右(糖度計測定),浸泡24 h。

第二次滲糖:在第一次滲糖的基礎上,加入蔗糖使糖液濃度為30%左右(糖度計測定),浸泡24 h,進行第二次滲糖。

第三次滲糖:在第二次滲糖的基礎上,加入蔗糖使糖液濃度為40%左右,浸泡48 h,進行第三次滲糖。

第四次滲糖:在第三次滲糖的基礎上,加入蔗糖使糖液濃度為45%左右,浸泡48 h,進行第四次滲糖。

干燥:將滲糖后的雙華李果在55 ℃的恒溫干燥箱中干燥至水分含量為25%左右取出,放于密閉的容器中儲存。

1.2.2 四種中草藥提取濃縮液最佳復配濃度的確定 前期單因素實驗的基礎上,以金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌為供試菌,以抑菌圈大小為指標,根據單一中草藥提取濃縮液的抑菌效果選取三個水平,利用響應面中的中心組合設計法設計這四種中草藥之間協同抑菌實驗,研究這四種草藥之間的協同作用。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.3 加權評分計算 根據細菌引起咽喉炎的影響程度,將金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌的權重設為30、40、30,計算公式如下:

Y(加權評分)=d1/d1max×30+d2/d2max×40+d3/d3max×30

其中,d1為提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小;d2為提取液對乙型鏈球菌的抑菌圈大小;d3為提取液對肺炎雙球菌的抑菌圈大小;d1、d2、d3均為平均值。

1.2.4 抑菌實驗方法 中草藥提取濃縮液的制備采用水提法提取中草藥,準確稱取10 g中草藥,加入20 mL蒸餾水,至于恒溫水浴鍋提取4 h,過濾(其中,中草藥的最佳提取條件為:胖大海和甘草的料液比為1∶30 (g/mL),最適溫度為70 ℃;金銀花的料液比為1∶25 (g/mL),最適溫度為70 ℃;薄荷的料液比為1∶30 (g/mL),最適溫度為90 ℃)。將濾液60 ℃下旋轉蒸發濃縮液至10 mL(若少于10 mL,加蒸餾水補足至刻度),作為母液(1 g生藥/mL),過0.2 μm濾膜除菌無菌密封4 ℃保存。在無菌工作臺中,將已滅菌的營養瓊脂培養基加熱到完全融化,倒在培養皿內,每皿約15～20 mL,凝固后用馬克筆標記牛津杯擺放位置。吸取100 μL已稀釋好后的菌懸液(107～108cfu/mL)打入凝固好的培養基表面,用無菌涂布棒將菌液涂布均勻,待培養基表面菌液干透后,在培養基表面垂直擺放牛津杯,輕輕加壓,使其與培養基接觸無空隙。在杯中加入已稀釋的中草藥提取濃縮液(100 mg/mL)200 μL,在37 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h后取出用游標卡尺量取抑菌圈直徑。以無菌水作空白對照,以山梨酸鉀溶液(0.12 g/mL)作陽性對照[12]。

1.2.5 雙華李涼果指標測定

1.2.5.1 感官評分 根據響應面結果優選三組中草藥復配比進行涼果制備,分別對其進行感官評分[13],篩選最佳復配比成分,感官評分見表2。

表2 感官評定方法Table 2 Sensory assessment method

1.2.5.2 顏色測定 采用全自動測色色差儀檢測果胚褐變情況[14]。其中L*表示樣品亮度,a*代表樣品紅綠程度,b*表示樣品黃藍程度。

1.2.5.3 質構測定 采用EZ-SX500N質構儀測定,測定條件為,探頭型號:A/W EG;測前速率:1 mm/s;測試速率:2 mm/s;測后速率:5 mm/s;下壓距離:5 mm;觸發力大小:5 g。以最大剪切力(g)表示樣品硬度[15]。

1.2.6 雙華李涼果清咽潤喉功效的評價

1.2.6.1 雙華李涼果提取液的制備 取制備的雙華李涼果樣品1 g置于100 mL蒸餾水中,在50 ℃條件下進行磁力攪拌5 h,離心(5000 r/min,15 min)收集上清液,稀釋成不同濃度(0.1、10、50、100、200、400、500 mg/L)進行細胞實驗。

1.2.6.2 細胞培養 所用細胞為小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系,于DMEM完全培養基中,置于5% CO2、37 ℃培養箱中傳代培養。細胞生長至70%～80%融合后進行傳代,1～2 d換一次培養液,4～6 d傳代一次[16-17]。所用操作均為無菌操作。

1.2.6.3 雙華李涼果提取液的細胞毒性 取對數生長期的RAW264.7細胞,用DMEM培養基調整細胞濃度,以每孔1×105個細胞接種到96孔板,每孔體積200 μL。37 ℃、5% CO2條件下培養24 h,更換培養基,加入不同濃度的雙華李涼果提取液共同培養18 h。培養結束后,每孔加入5 mg/mL MTT試劑20 μL繼續孵育4 h,棄上清后每孔加入150 μL DMSO并振蕩30 min溶解沉淀[17-18]。酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光值(OD值),以無細胞僅含培養基的孔作為空白,以正常細胞孔為對照,以含樣品的孔為樣品組,通過以下公式計算得到相對活性:

1.2.6.4 雙華李涼果提取液對PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子分泌的影響 將對數生長期RAW264.7細胞以1×105/孔的濃度接種于12孔板,每孔體積2 mL。置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。將RAW264.7細胞隨機分為對照組,雙華李樣品組(200,100,50,10,0.1 mg/L),LPS組(1 mg/L)和LPS(雙華李組,繼續培養24 h后收集細胞培養上清液,依小鼠PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書測定含量。各炎癥因子標準曲線為:TNF-α,y=0.0013x+0.0373(R2=0.9990);IL-1β,y=0.003x-0.021(R2=0.9994);IL-6,y=0.0029x+0.1023(R2=0.9975);PGE2,y=0.0043x+0.079(R2=0.9948)。

1.2.6.5 雙華李涼果對NO炎癥因子分泌的影響 于96孔板中,每孔加RAW264.7細胞懸液(1.0×105cells/mL)100 μL,置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育2 h,棄去培養液,加入含不同濃度藥物的新鮮完全培養液100 μL(陽性對照不加藥),繼續培養2 h后,加入含LPS的完全培養液使終濃度為1 mg/mL。37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后,將細胞上清液轉移至另一96孔細胞培養板,各孔加入Griess A和Griess B混合試劑(1∶1)100 μL,暗處避光反應10 min,于540 nm處測定OD值[19]。根據標準曲線(y=0.0048x+0.0028,R2=0.9997)計算待測樣品中NO含量。

1.3數據統計分析

實驗數據采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS Statistics 17.0.1軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1四種中草藥提取濃縮液最佳復配濃度的確定

實驗結果見表3。結果顯示,利用Design-Expert8.0.6程序對30個實驗點的響應值進行回歸擬合,以加權分為指標得到二次多項回歸模擬方程為:

Y=65.72-2.13A-1.76B-2.54C-1.94D+2.41AB+2.60AC+2.02AD+0.82BC+0.60BC+2.40CD-0.87A2+4.42B2+3.68C2+0.68D2

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and result

表4 回歸系數模型及方差分析Table 4 Regression coefficient model and variance analysis

注：*代表0.05水平顯著;**代表0.01水平顯著。

由表4的分析結果可知,整體模型的“Prob>F”值為0.0090,表明模型的擬合度較好,能較好的對響應值進行預測。表中各個因素的F值越大表明該因素對抑菌效果的影響越顯著,各中草藥提取濃縮液對復配后抑菌效果的影響大小為:胖大海>金銀花>薄荷>甘草。同時,回歸方程的二次項B2和C2對復配抑菌效果均有極顯著影響,表明各因素對響應值不是簡單的線性關系,而是呈二次關系。

對所建立的數學模型進行分析,得到的四種中草藥提取濃縮液的最佳復配濃度為:金銀花為87.13 mg/mL、甘草為92.31 mg/mL、胖大海為52.02 mg/mL、薄荷為88.92 mg/mL,預測可得到復配后的抑菌加權分為92.84。為了檢測RSM的實驗結果可靠性,根據以上實驗結果進行了驗證。考慮實際操作性,調整各中草藥提取濃縮液的濃度為:金銀花為87 mg/mL、甘草為92 mg/mL、胖大海為52 mg/mL、薄荷為89 mg/mL,測得該條件下四種中草藥復配后抑菌加權分為91.63(對三種供試菌的抑菌圈直徑分別為16.92、15.32、14.87 mm),抑菌加權評分為結果與模型預測得很接近。

考慮到制備的涼果成品還需要保證外觀和口感,因此另優選其它兩組復配比(響應面預測的較高評分組)和最優復配比(記為復配組1)進行感官評分對比,以確定最終的四種中草藥的復配比,所優選的另外兩組分別記為復配組2(金銀花56 mg/L、甘草59 mg/L、胖大海61 mg/L、薄荷105 mg/L)、復配組3(金銀花95 mg/L、甘草59 mg/L、胖大海52 mg/L、薄荷116 mg/L)。

2.2三組雙華李涼果樣品的感官評分及質構對比

表5結果顯示,三組樣品感官評分有顯著性差異(p<0.05),其中復配組1的感官評分均比復配組2和組3低,樣品組2和組3的感官評分沒有顯著性差異(p>0.05),分別為81和83。

三組樣品涼果在硬度、彈性上沒有顯著差異(p>0.05),但在色澤方面,樣品組1的L*值和b*值均比樣品組2和組3低,而樣品2和3之間沒有顯著性差異(p>0.05),說明樣品1顏色整體較暗,分析原因是由于樣品1中加入的甘草提取液含量比其他兩組高,所以導致涼果果胚顏色較暗。

表5 三組雙華李樣品組的質構及色澤Table 5 The texture and color of the three groups

根據以上對三組雙華李涼果樣品的感官評分、質地以及色澤方面的分析,確定復合組2為四種中草藥提取濃縮液的最佳組合,在此基礎上結合涼果的傳統加工工藝制備出清咽潤喉雙華李涼果,并進行抗炎活性評價。

2.3RAW264.7巨噬細胞細胞生長狀態

RAW264.7巨噬細胞是貼壁生長的細胞,當細胞重懸后于培養液中呈現透明狀,橢圓形;傳代2～4 h后開始貼壁,8 h以后大部分細胞貼壁,細胞生長很快,在倒置顯微鏡下觀察,可見細胞形態以類圓形和不規則多邊形為主,少量有偽足。從圖1中可以看到細胞之間緊密連接,并且貼壁很緊,此時細胞生長狀況良好。

圖1 RAW264.7細胞,細胞生長狀況(100×)Fig.1 RAW264.7 cells,cell growth status(100×)

2.4雙華李涼果提取液的細胞毒性

采用MTT法檢測細胞活性,用不同濃度(25,50,100,200,400,500 mg/L)雙華李涼果提取液處理RAW264.7細胞,孵育18 h,結果如圖2顯示。圖2表明,不同濃度的雙華李涼果提取液處理RAW264.7細胞18 h后,以對照組細胞活性為100%作比較,樣品在劑量400 mg/L內對細胞活性沒有顯著性差異(p>0.05),說明在此范圍內所選的雙華李涼果的濃度不影響RAW264.7細胞的增殖活性,對細胞無毒性作用。此結果為后續實驗設計雙華李涼果劑量組提供參考依據,由此可以說明后續實驗中檢測的結果,不是由細胞死亡引起,而是雙華李涼果直接或間接抗炎作用的結果。

圖2 雙華李涼果樣品對RAW264.7巨噬細胞毒性分析Fig.2 Effect of shuanghua preserved fruit on RAW264.7 macrophage toxicity

2.5雙華李涼果提取液對PGE2、TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO分泌的影響

圖3為雙華李涼果提取液對PGE2、TNF-α、IL-6、IL-lβ、NO幾種炎癥因子分泌的影響。圖中結果所示,對于TNF-α、IL-6、IL-lβ、NO四種炎癥因子,LPS誘導的模型組與空白組之間細胞炎癥因子的分泌水平均有顯著性差異(p<0.05),說明造模成功,與模型組對照,雙華李涼果提取液一定濃度條件下均能夠顯著降低炎癥因子的分泌水平(p<0.05),當雙華李涼果提取液濃度為50 mg/L時對抑制TNF-α的分泌作用最強,抑制率達到54.42%;當濃度在50、200、400 mg/L時對IL-lβ的抑制率分別為32.93%、35.83%、38.50%,繼續增加濃度后抑制效果不再顯著增加(p>0.05);當濃度為50 mg/L時對IL-6的抑制作用最強,抑制率達到69.14%;當濃度增加到200 mg/L時,對NO的分泌有顯著抑制作用(p<0.05),此時抑制率最大為27.17%。圖3結果所示,LPS誘導的模型組與空白組之間的PGE2含量沒有顯著性差異(p>0.05),說明LPS刺激細胞后并沒有引起PGE2的變化,但雙華李涼果提取液濃度在200 mg/L時對細胞因子PGE2的分泌有顯著抑制作用(p<0.05),抑制率為9.52%,其他濃度沒有顯著影響(p>0.05)。

在炎癥反應中,與對照組相比,一定濃度下研制的雙華李涼果提取液均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低,而對PGE2的分泌沒有顯著性影響。綜合幾種對炎癥因子的抑制作用,當雙華李涼果提取液濃度在50 mg/L時對細胞整體炎癥因子的抑制作用最強。在此最強抑制濃度下,對TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,Choi,J[17]等人的研究中顯示陽性抗炎藥物吲哚美辛(3.58 mg/L)對于TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為41.57%、44.33%、41.19%、35.15%,說明此雙華李涼果具有較好的抗炎效果。

圖3 雙華李涼果提取液對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌PGE2(a)、TNF-α(b)、IL-1β(c)、IL-6(d)和NO(e)的影響Fig.3 Effect of shuanghua preserved fruit on PGE2(a),TNF-α(b),IL-1β(c),IL-6(d)and NO(e)in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結論

金銀花、甘草、胖大海、薄荷四種中草藥提取濃縮液的最佳復配濃度為:金銀花56 mg/mL、甘草59 mg/mL、胖大海61 mg/mL、薄荷105 mg/mL,此時復配制備的涼果感官質量最好。采用LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞為炎癥模型中,雙華李涼果樣品在400 mg/L內對細胞的生長沒有毒性。在炎癥反應中,LPS誘導的巨噬細胞的炎癥因子分泌量與空白組對照有極顯著性增加,且一定濃度的樣品均能使炎癥因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的分泌顯著降低,而對PGE2的分泌沒有顯著性影響,當雙華李涼果提取液濃度達到50 mg/L時對細胞驗證因子的抑制作用最強。在此最強抑制濃度下,對TNF-α、IL-lβ、IL-6、NO的抑制率分別為54.42%、69.14%、38.50%、27.17%,說明所研制的雙華李涼果具有較好的抑菌抗炎效果。

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Preparationandevaluationofshuanghuaplumpreservedfruitwithqingyaneffect

SONGQian,ZHOUAi-mei*,WANGShuang,HUYan-min,FANGQiong-mi,LIXue-na,LINChun-xiu

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

With shuanghua plum being used as material,the optimum mixture ratio of the extract of four Chinese herbs was optimized by the response surface method using bacteriostatic testinvitro,prepared a functional preserved fruit with qingyan effect was prepared in combination with the traditional processing technology. LPS-induced RAW264.7 macrophage inflammatory model was adopted to determine the anti-inflammatory activity of shuanghua plum preserved fruit using inflammatory cytokines(TNF-α,IL-lβ,IL-6,PGE2,NO)as indicators. The results showed that the optimal combination ratio of the extract of the four herbs were honeysuckle 56 mg/mL,licorice 59 mg/mL,sterculia scaphigera 61 mg/mL and peppermint 105 mg/mL. In the inflammatory response,the samples at appropriate concentrations could decrease inflammatory cytokines(TNF-α,IL-lβ,IL-6,NO)significantly(p<0.05),while there was no significant effect on PGE2secretion(p>0.05). The strongest inhibitory effect of the extract of shuanghua plum preserved fruit was obtained at the concentration of 50 mg/L. Under this concentration,the inhibition rate against TNF-α,IL-l,IL-6 and NO was 54.42%,69.14%,38.50% and 27.17%,respectively,demonstrating the anti-inflammatory effect of the developed shuanghua plum preserved fruit by decomposing the inflammatory factors. This showed that the shuanghua plum preserved fruit can inhibit the secretion of inflammatory factors,with qingyan effect.

shuanghua plum;preserved fruit;the extract of Chinese herbs;lipopolysaccharide;anti-inflammation

2017-01-13

宋倩(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬加工研究，E-mail：songq0609@163.com。

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周愛梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水產品及農產品深加工研究，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

廣東省省部產學研結合項目(2013B090600003)。

TS255.1

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1002-0306(2017)21-0174-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.035