肉桂醛對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

,,,,,

(中國藥科大學工學院,江蘇南京 211198)

肉桂醛對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

綦國紅,井佳麗,楊志萍,陳貴堂,王海翔,程抒劼

(中國藥科大學工學院,江蘇南京 211198)

本文擬研究肉桂醛在非抑菌濃度條件下對熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)FML05-2生物膜形成的抑制作用。首先測定了肉桂醛對模式細菌紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)CVO26紫色素產生的影響;再對熒光假單胞菌FML05-2形成的生物膜以及與生物膜形成有關的重要因素胞外多糖進行了測定。結果表明:在非抑菌濃度40、20 μg/mL條件下,肉桂醛對紫色桿菌CVO26紫色素的產生具有抑制作用,抑制率分別為31.53%、17.90%;對熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制率分別為44.22%、21.77%;對熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖產生的抑制率分別為15.72%、5.34%。因此,肉桂醛在非抑菌濃度條件下對熒光假單胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用。

肉桂醛,群體感應抑制,熒光假單胞菌,生物膜,胞外多糖

細菌生物膜(biofilm,BF)是細菌為了適應環境和維持自身生命而形成的形如膜狀的結構,保護膜內細菌免受外界惡劣環境的影響,為細菌生長提供天然屏障。食品腐敗菌以及食源性致病菌常常通過形成生物膜附著在食品、食品加工設備、包裝材料等表面,難以消殺與清除,從而形成持續性的污染,成為食品安全的一大隱患[1-2]。因此研究如何減少食源性致病菌與食品腐敗菌生物膜的形成具有重要意義。研究表明細菌生物膜的形成受群體感應現象調控[3-5],因此可以通過群體感應抑制原理來減少或抑制生物膜的產生,此方法不同于基于抑菌與殺菌而抑制目標菌生物膜的形成的原理,不會導致抗性菌株的產生。目前研究較多的群體感應抑制方法是利用群體感應抑制劑即群體感應信號分子的類似物來干擾群體感應現象,從而減少或抑制由群體感應現象調控的目標性狀的表達[6-7]。

肉桂醛(cinnamaldhyde),又名桂皮醛,有獨特的香味,是肉桂揮發油的主要活性物質。研究表明,肉桂醛對食源性致病菌大腸桿菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌以及導致番茄、胡蘿卜等霉變的霉菌等均具有很好的抑制作用[8-10];對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、煙曲霉菌等產生的生物膜也具有抑制作用[8,10]。國外文獻報道,肉桂醛對歐文氏菌、耶爾森氏菌的群體感應系統具有抑制作用[11],但對熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)群體感應抑制作用目前國內外未見報道。

熒光假單胞菌是一種典型的嗜冷菌,是導致食品腐敗的常見細菌,多數菌株生長過程中產生生物膜。且該菌生物膜的形成受其自身群體感應系統調控[12-13]。本文基于群體感應抑制的原理研究肉桂醛在非抑菌濃度條件下對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用,研究的視角不同于已有的研究,即在抑菌條件下對食品腐敗菌生物膜形成的抑制作用,從而揭示肉桂醛對熒光假單胞菌群體感應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種與培養條件：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)FML05-2產生生物膜與N-?；呓z氨酸內酯類信號分子[12];紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)CVO26,是工程菌株,不產生N-己酰高絲氨酸內酯,也不產生紫色色素,并且色素的產生受N-己酰高絲氨酸內酯(N-hexanoyl-homoserine lactone,C6-HSL)信號分子的調控[12]。二者均使用LB培養基(氯化鈉10 g,胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,蒸餾水1 L,pH7.0)于28 ℃ 150 r/min振蕩培養。紫色桿菌CVO26培養時添加卡那霉素至終濃度為20 μg/mL。

肉桂醛分析標準品≥99.5%(GC) Aladdin試劑公司;C6-HSL Sigma公司;硫酸卡那霉素注射液 四川華蜀動物藥業有限責任公司;二甲基亞砜(AP) 上海泰坦化學有限公司;苯酚(AP) 國藥集團化學試劑有限公司;濃硫酸(AP) 南京化學試劑股份有限公司。

FLX800多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Microscope Eclipse 80i光學顯微鏡 日本Nikon;CR21G 高速冷凍離心機 日立高新技術公司;HZC-250恒溫振蕩培養箱 蘇州太倉實驗設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 肉桂醛溶液的制備 取2.00 mg肉桂醛溶于1 mL 1%的二甲基亞砜溶液中,得到濃度為2000 μg/mL的肉桂醛母液,-20 ℃保存備用。肉桂醛測試濃度用無菌LB培養基對母液按比例進行稀釋。

1.2.2 對紫色桿菌CVO26、熒光假單胞菌FML05-2最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照文獻[4]將活化好的菌液按2%比例接種于無菌新鮮LB培養基中,培養至菌體密度OD600 nm約為0.4,取4.5 mL的菌液分裝于標記好的無菌大試管中,加入0.5 mL不同濃度的肉桂醛溶液,對照組為等量無菌LB培養基,于28 ℃,150 r/min振蕩培養24 h,觀察菌液是否渾濁,同時測定菌液OD600 nm值,確定MIC。

1.2.3 對紫色桿菌CVO26、熒光假單胞菌FML05-2的生長抑制作用 參照文獻[4],按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的菌液,分別于0、2、4、6、8、10、12 h時取200 μL培養液加入96孔板中,用酶標儀測定OD630 nm值,取三次測量數值的平均值,繪制生長曲線。

1.2.4 對紫色桿菌CVO26紫色素產生的抑制作用 參照文獻[5]按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的CVO26菌液,肉桂醛的最終質量濃度為20、40 μg/mL,對照組為無菌LB培養基。同時添加C6-HSL至終濃度為5 μmol/mL,于28 ℃,150 r/min振蕩培養約7 h。取3 mL培養液10000 r/min 4 ℃離心10 min,棄上清,加入3 mL二甲基亞砜,充分混勻。10000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清,分光光度計測定580 nm吸光度。按下式計算紫色素抑制率:

抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100

1.2.5 對熒假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制作用 光學顯微鏡對生物膜的定性觀察,根據文獻[5],按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的菌液,分裝于錐形瓶中,將1.5 cm×1.5 cm的無菌玻璃片置于錐形瓶內,28 ℃靜置培養48 h后,棄培養液,添加含有肉桂醛的新鮮LB培養基后繼續靜置培養48 h。取出玻璃片,無菌水沖洗表面浮菌,45 ℃干燥30 min,0.2%的結晶紫溶液染色2 min。無菌水洗掉多余的染色劑,45 ℃干燥30 min。用光學顯微鏡觀察,拍照。對生物膜的定量測定,參照文獻[6],按上述方法操作,無菌輸液管片代替玻璃片。輸液管片45 ℃干燥后,用無水乙醇洗脫3 min,取200 μL洗脫液加入96孔板中,酶標儀測定490 nm處的吸光度。按1.2.4方法計算抑制率。

1.2.6 對熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖的抑制作用 按1.2.2的方法制備含有肉桂醛的菌液,28 ℃振蕩培養24 h。取菌液10000 r/min 4 ℃離心30 min,取上清,加入上清液3倍體積的冷乙醇,4 ℃靜置24 h,12000 r/min 4 ℃離心10 min,得沉淀,2倍體積的蒸餾水稀釋沉淀,參照苯酚硫酸法[14]進行測定,即2 mL樣品溶液加入1 mL 5%的苯酚溶液,再加入5 mL的濃硫酸,充分搖勻,靜止30 min后于490 nm處測量吸光度,蒸餾水對照,按1.2.4方法計算抑制率。

2 結果與分析

2.1對紫色桿菌CVO26和熒光假單胞菌FML05-2最小抑菌濃度(MIC)

觀察紫色桿菌CVO26與熒光假單胞菌FML05-2在含有不同濃度肉桂醛的培養基中的生長情況,同時測定培養物的OD600 nm值,確定紫色桿菌CVO26的MIC為100 μg/mL,熒光假單胞菌FML05-2的MIC為150 μg/mL。

2.2對紫色桿菌CVO26和熒光假單胞菌FML05-2生長抑制作用

為進一步驗證肉桂醛在MIC濃度以下對CVO26的抑制作用,對其生長曲線進行了測定,并與對照進行了顯著性檢驗,結果表明(圖1),肉桂醛濃度≤40 μg/mL時,紫色桿菌CV026的生長趨勢與對照組無顯著差異(p>0.05),即肉桂醛在此濃度下對其生長沒有抑制作用;而肉桂醛濃度≥50 μg/mL時,生長情況與對照相比有顯著差異(p<0.05)(50 μg/mL以上濃度數據未顯示)。

圖1 肉桂醛對CVO26的生長抑制作用Fig.1 The growth inhibition of cinnamalhyde to CVO26

用同樣的方法,對熒光假單胞菌FML05-2的生長曲線進行了測定和分析,結果(圖2)表明,肉桂醛濃度在≤40 μg/mL時對熒光假單胞菌FML05-2生長無抑制作用,與對照無顯著性差異(p>0.05),而濃度為50 μg/mL 時對FML05-2生長具有抑制作用,與CVO26一樣其抑制作用主要發生在對數生長期,而到達穩定期時菌液的OD630 nm值與對照無顯著差異。因此后續肉桂醛對二菌的測試濃度均確定為≤40 μg/mL。

圖2 肉桂醛對FML05-2的生長抑制作用Fig.2 The growth inhibition of cinnamalhyde to FML05-2

2.3對紫色桿菌CVO26紫色素產生的抑制作用

由圖3可知,肉桂醛在非抑菌濃度條件下對CVO26紫色素的產生具有抑制作用,并且隨肉桂醛濃度的增加紫色素的抑制率也隨之增加,濃度為40 μg/mL時抑制率達31.53%。

圖3 肉桂醛對CVO26紫色素產生的抑制作用Fig.3 Violacein production inhibition in CVO26 by cinnamaldhyde

2.4對熒光假單胞菌FML05-2生物膜產生的抑制作用

利用光學顯微鏡在400倍條件下對細胞爬片上的生物膜形態進行觀察,結果表明(圖4),肉桂醛對熒光假單胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用,生物膜上的細胞密度、細胞團塊的大小隨著肉桂醛濃度的升高而降低。當肉桂醛濃度為40 μg/mL時,膜上細胞密度變得很稀疏。為進一步驗證肉桂醛對生物膜的抑制作用,進行了定量測定。結果如圖5所示,生物膜的抑制率隨著肉桂醛濃度的升高而增大,40 μg/mL時達到44.22%,與顯微鏡觀察結果相吻合。

圖4 肉桂醛對FML05-2生物膜形成的抑制作用(400×)Fig.4 Inhibition of cinnamalhyde on biofilm formation of FML05-2(400×)注:A:對照;B:20 μg/mL;C:30 μg/mL;D:40 μg/mL。

圖5 肉桂醛對FML05-2生物膜形成的抑制作用Fig.5 Inhibition of cinnamalhyde on biofilm formation of FML05-2

2.5對熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖產生的抑制作用

胞外多糖是構成生物膜的重要成分,影響生物膜產生的因素也會影響胞外多糖的產生,因此對熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖的產生進行了測定,由圖6可知,肉桂醛在不抑制熒光假單胞菌胞生長的情況下對其胞外多糖的產生具有抑制作用,且隨著濃度增加,抑制率隨之增加,40 μg/mL時抑制率為15.72%。

圖6 肉桂醛對FML05-2胞外多糖產生的抑制作用Fig.6 Inhibition of EPS production to FML05-2 by cinnamalhyde

3 結論

本文首先利用群體感應抑制研究的模式菌紫色桿菌CVO26對肉桂醛的群體感應抑制活性進行了初步測定,發現肉桂醛具有抑制其紫色素產生的能力,40 μg/mL時抑制率為31.53%。然后研究了肉桂醛在非抑菌濃度條件下對熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制作用,發現肉桂醛處理導致生物膜結構松散,細胞密度與細胞團塊大小明顯降低;對生物膜定量測定結果表明40 μg/mL時生物膜抑制率為44.22%;對生物膜的主要構成成分胞外多糖進行測定,40 μg/mL時胞外多糖的抑制率為15.72%。因此,肉桂醛對熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成具有抑制作用,此種作用不是由于肉桂醛對FML05-2抑制生長所致,而是通過對其群體感應抑制作用所致。

[1]張曙梅,徐向榮,徐浩. 細菌生物膜群體感應系統研究進展[J].生物技術通報,2016,32(12):1-6.

[2]張翼,陳雅蘅,周幗萍,等. 克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)的生物膜檢測和藥敏性分析[J].食品科學,2015,36(21):129-134.

[3]You J L,Xue X L,Cao L X,et al. Inhibition of Vibrio biofilm formation by a marine actinomycete strain A66[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,76(5):1137-1144.

[4]Packiavathy I A S V,Agilandeswari P,Musthafa K S,et al. Inhibition of biofilm development of uropathogens by curcumin-An anti-quorum sensing agent from Curcuma longa[J]. Food Chemistry,2014,148:453-460.

[5]Abraham S V P I,Palani A,Ramaswamy B R,et al. Anti-quorum sensing and antibiofilm potential of Capparisspinosa[J]. Archives of Medical Research,2011,42:658-668.

[6]Packiavathy I A S V,Agilandeswari P,Musthafa k S,et al. Antibiofilm and quorum sensing inhibitory potential of Cuminumcyminum and its secondary metabolite methyl eugenol against Gram negative bacterial pathogens[J]. Food Research International,2012,45:85-92.

[7]Rasmussen T B,Bjarnsholt T,Skindersoe M E,et al. Screening for Quorum-Sensing Inhibitors(QSI)by Use of a Novel Genetic System,the QSI Selector[J]. Journal of Bacteriology,2005,187(5):1799-1814.

[8]張赟彬,劉笑宇,姜萍萍,等. 肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機理研究[J]. 現代食品科技,2015,31(5):31-35.

[9]索標,盧楊柳,王娜,等.肉桂醛對豬肉糜中單核細胞增生李斯特菌的抑制作用及其機制[J].食品安全質量檢測學報,2016,7(6):2211-2214.

[10]鄔麗紅,陳一強,孔晉亮,等.肉桂醛對煙曲霉菌體外生物膜的影響[J].重慶醫學,2016,45(3):326-328.

[11]Truchado P,Tomás-Barberán F A,Larrosa M,et al. Food phytochemicals act as Quorum Sensing inhibitors reducing production and/or degrading autoinducers of Yersinia enterocolitica and Erwinia carotovora[J]. Food Control,2012,24:78-85.

[12]綦國紅,董明盛,陳曉紅,等.魚源假單胞菌群體感應信號分子與腐敗特性相關關系研究[J].中國農業科學,2007,40(7):1486-1491.

[13]Myszka K,Schmidt M T,Majcher M,et al. Inhibition of quorum sensing-related biofilm ofPseudomonasfluorescensKM121 by Thymus vulgare essential oil and its major bioactive compounds[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2016,114:252-259.

[14]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,1994:102.

InhibitionofbiofilmformationinPseudomonasfluorescensbycinnamaldhyde

QIGuo-hong,JINGJia-li,YANGZhi-ping,CHENGui-tang,WANGHai-xiang,CHENGShu-jie

(School of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

To study the inhibition of development of biofilm inPseudomonasfluorescensFML05-2 by cinnamaldhyde at the non inhibitory concentration. Firstly,it was studied that the effect of the cinnamaldhyde on the purple pigment production byChromobacteriumviolaceumCVO26 as model bacteria,then determined the biofilm formation and extracellular polysaccharide(EPS)production that was important factors correlated with the biofilm formation inP.fluorescensFML05-2. The results indicated that the cinnamaldhyde inhibited the purple pigment production ofC.violaceumCVO26,the inhibition rates were 31.53% and 17.90%,respectively. The inhibition rates of the biofilm development were 44.22%,21.77%,the inhibition rates of EPS production were 15.72%,5.34% inP.fluorescensFML05-2 at the non inhibitory concentration of 40 μg/mL and 20 μg/mL. The results suggest that the cinnamaldhyde can inhibit the development of biofilm inP.fluorescensFML05-2 at the non inhibitory concentration

cinnamaldhyde;quorumsensing inhibition;Pseudomonasfluorescens;biofilm;extracellular polysaccharide

2016-12-23

綦國紅(1972-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物與生物技術，E-mail：qghcpu@163.com。

細菌群體感應對魚蝦腐敗過程的調控作用及其分子機制(30700627)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)21-0147-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.030