超聲波輔助復合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝優化

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(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院 甘肅蘭州 730050;2.蘭州名德農牧科技有限公司,甘肅蘭州 730010)

超聲波輔助復合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝優化

張丙云1,王聰1,謝言言1，任海偉1,*,范文廣1,黃思瑤1,李志忠1,陳偉2

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院 甘肅蘭州 730050;2.蘭州名德農牧科技有限公司,甘肅蘭州 730010)

為實現羊胎盤深度開發利用,以肽得率和水解度為指標,篩選確定多種蛋白酶復合水解的最佳組合方案,并利用響應面法優化超聲波輔助復合酶法水解制備羊胎盤肽的預處理參數。結果表明,響應面法優化后的超聲預處理參數為超聲時間18 min、溫度28 ℃和功率420 W,超聲波預處理后羊胎盤經木瓜蛋白酶和風味酶聯合同步復合酶解制備羊胎盤肽的肽得率為39.89%,水解度為21.78%;該最優條件下平均肽鏈長度為4.59,分子量約500～600。結論:超聲波輔助復合酶法制備藏系綿羊胎盤肽的工藝可行且有效。

藏系綿羊,羊胎盤肽,木瓜蛋白酶,風味酶,超聲波預處理,工藝優化

我國是養羊大國,每年可供開發利用的羊胎盤潛藏量高達450萬個[1]。羊胎盤含有豐富的蛋白質、氨基酸和微量元素,食用和藥用價值極高[2]。但大多數羊胎盤被廢棄處理,加工利用量不足總資源量的3%。同時,羊的生殖期較為集中,導致大量羊胎盤在短期內難以被加工處理,造成巨大的資源浪費和環境污染[3]。

近年來,一些學者從活細胞素[4]、免疫調節因子[5]、保健品膠囊[6]、活性肽開發[7]等角度對羊胎盤進行開發利用;其中有關活性肽的研究多集于在制備工藝(化學合成法、微生物發酵法、酶解法)和活性研究(抗氧化活性、免疫活性)等方面[1-2,7]。研究表明,酶解法具有生產條件溫和、水解程度易于控制、可定位生產特定的肽、產品安全性高、生產成本低廉等特點,是制備生物活性肽最常用的方法之一[8]。然而,酶法制備過程中,蛋白酶具有相對的底物專一性,底物不同對應的酶切作用位點也不一樣,有必要針對特定的羊胎盤原料進行蛋白酶篩選,并尋找能夠提高胎盤肽得率的預處理方法。

藏系綿羊是我國青藏高原寶貴的遺傳資源之一,主要分布于青海、甘南等高海拔寒旱地區,具有耐高寒、耐缺氧、適應性強等生物學特性[9]。本文以藏系綿羊胎盤肽的開發為目標,詳細考察木瓜蛋白酶和風味酶制備羊胎盤肽的酶解方案,在此基礎上,采用響應面法優化超聲波預處理參數,以期得到制備羊胎盤肽的適宜預處理條件,為藏系綿羊胎盤肽的資源化利用奠定技術基礎。

表1 雙酶組合酶解的參數設定Table 1 Parameter setting of the two enzymatic combination hydrolysis

注：第一次加酶水解6 h后,滅酶或不滅酶,第二次加酶繼續水解。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮藏系綿羊胎盤 羊體內取出后-20 ℃冷庫低溫速凍保存,蘭州名德農牧科技有限公司；木瓜蛋白酶 酶活力800000 U/g,廠家推薦適宜pH6.5～7.0,適宜溫度50 ℃;風味酶 酶活力20000 U/g,廠家推薦適宜pH7.0～7.5,適宜溫度50 ℃;菠蘿蛋白酶 酶活力500000 U/g,廠家推薦適宜pH6.8～7.2,適宜溫度45 ℃;中性蛋白酶 酶活力200000 U/g,廠家推薦適宜pH7.0,適宜溫度50 ℃;堿性蛋白酶 酶活力20000 U/g,廠家推薦適宜pH8.0～10.0,適宜溫度50 ℃。酶 購于南寧龐博生物工程有限公司。

FA25高剪切分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司;L-550臺式低速離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;KQ-600DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SH220N石墨消解儀、K9840自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 原料預處理 新鮮羊胎盤洗凈、瀝干水分后剪碎,用高剪切分散乳化機均質,并以質量比1∶5加入蒸餾水,20 ℃恒溫水浴2 h,然后3900 r/min離心20 min,取其沉淀(羊胎盤提取殘留物)作為酶解原料[10]。

1.2.2 蛋白水解酶的篩選 以肽得率和水解度為指標,從木瓜蛋白酶、風味酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶中篩選適宜的蛋白水解酶,酶解條件依據參考文獻統一設置為酶添加量4000 U/g,酶解時間1 h,無酶添加作為對照組[11]。同時,通過酶解液的色澤、渾濁程度和腥味對不同處理組的酶解液進行感官評價[12]。

1.2.3 木瓜蛋白酶和風味酶的酶解條件確定 準確稱取2.00 g羊胎盤提取殘留物36份置于錐形瓶中,分別加入100 mL、pH分別為6.5(木瓜蛋白酶)和7.5(風味酶)的磷酸緩沖液,再按照酶添加量2000、4000、6000、8000和10000 U/g梯度加入相應的酶進行水解,無酶添加作為對照組。50 ℃恒溫酶解,時間分別為1、2、3、4、5和6 h[13]。酶解結束后立即沸水浴10 min滅酶,然后快速冷卻到室溫并3900 r/min離心20 min,取上清液于100 mL容量瓶中定容,分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定總氮和氨基氮含量,計算肽得率和水解度,確定適宜的酶添加量和酶解時間[14-15]。

1.2.4 雙酶復合酶解的組合方案確定 木瓜蛋白酶的適宜pH6.5～7.0,風味酶的適宜pH7.0～7.5,因此在pH7.0,50 ℃條件下,按照表1中不同酶解組合方案進行實驗,水解結束后于3900 r/min離心20 min,取上清液于100 mL容量瓶中定容,分析上清液的總氮和氨基氮含量,根據肽得率和水解度等指標確定適宜的組合方案。

1.2.5 單因素實驗 稱取一定量羊胎盤提取殘留物,以肽得率和水解度為指標,按照以下設計進行單因素實驗,確定各因素的取值范圍。各單因素水平設計如下:固定超聲溫度40 ℃、超聲功率240 W,超聲時間分別取5、10、15、20、25、30 min。固定超聲功率240 W、超聲時間20 min,超聲溫度分別取25、30、35、40、45、50 ℃。固定超聲時間20 min、超聲溫度30 ℃,超聲功率分別取240、300、360、420、480、500 W。

1.2.6 響應面實驗 在1.2.5單因素實驗基礎上,對超聲時間、超聲溫度、超聲功率3個因素進行響應面優化,確定酶解法制備羊胎盤肽的適宜工藝參數。

1.2.7 測定方法 水分測定參照GB/T 6435-2014;蛋白質的測定參照GB/T 5009.5-2010。水解度、肽得率和平均肽鏈長度分別按式(1)、式(2)、式(3)計算[14-16]。平均分子量的計算參照文獻[17]。

式(1)

式(2)

式(3)

式中:DH表示水解度,%;N1表示上清液氨基氮,g;N表示原料總氮,g;PY表示肽得率,%;N2表示上清液總氮,g;PCL表示平均肽鏈長度;W表示原料總蛋白質,g。

1.2.8 數據處理 用Excel軟件處理基礎數據,用SPSS軟件對實驗結果進行數據統計分析,對不同處理組數據進行方差分析,p<0.05代表數據存在顯著性差異。用Design～Expert V8.0.6對超聲波預處理參數進行優化。

2 結果與討論

2.1羊胎盤肽蛋白水解酶的篩選

由圖1可知,與對照組(未添加蛋白酶)相比,添加5種蛋白酶作用后的肽得率和水解度均顯著(p<0.05)提高,且木瓜蛋白酶對應的肽得率和水解度分別為22.93%和13.53%,肽得率顯著(p<0.05)高于風味酶(17.25%)、中性蛋白酶(19.18%)、堿性蛋白酶(21.75%)和菠蘿蛋白酶(21.70%);水解度也顯著(p<0.05)高于風味酶(12.94%)、中性蛋白酶(13.67%)和堿性蛋白酶(11.76%),但顯著(p<0.05)低于菠蘿蛋白酶(15.79%)。計算不同條件下的平均肽鏈長度和平均分子量發現,木瓜蛋白酶作用后的平均肽鏈長度為7.39,肽平均分子量約831.01,明顯高于菠蘿蛋白酶(6.33,714.64),與中性蛋白酶(7.32,822.68)相近,但明顯低于風味酶(7.73,868.08)和堿性蛋白酶(8.50,953.37)。這是因為不同種類蛋白酶的酶解作用位點有很大差異,木瓜蛋白酶酶切位點在Arg-,Lys-,Phe-,X-等位置,特異性廣泛;風味酶酶切位點有Arg-,Lys-,Leu-,Val-等,菠蘿蛋白酶酶切位點在Lys-,Ala-,Tyr-,Gly-,中性蛋白酶的酶切位點在Leu-,Phe-等,堿性蛋白酶酶切位點在Ala-,Leu-,Val-,Tyr-,Phe-,Trp-[10,18-19]。藏系綿羊胎盤中Asp、Glu、Leu、Lys、Arg和Val等氨基酸含量豐富[9],木瓜蛋白酶和風味酶在Lys、Leu和Arg處均有切割位點,且木瓜蛋白酶能作用的位點較多,使木瓜蛋白酶作用后的肽得率和水解度相對較高。

圖1 不同種類蛋白酶的篩選Fig.1 Screening of different kinds of protease注:圖中不同大寫字母表示肽得率差異顯著(p<0.05), 不同小寫字母表示水解度差異顯著(p<0.05)；圖2～圖5同。

從表2酶解液的感官分析結果可知,風味酶具有一定的脫腥和調節風味的作用;與風味酶相比,盡管堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶有較好的酶解效果,但這三種酶作用后的酶解液腥味較重,這與朱蓓薇[12]等研究結果一致。綜合考慮酶解效果、感官質量等因素,選擇木瓜蛋白酶和風味酶進行后續酶解實驗。

表2 不同種類蛋白酶作用后酶解液的感官評價Table 2 Sensory evaluation of enzymatic hydrolysate by different proteases

2.2木瓜蛋白酶和風味酶的酶解條件確定

2.2.1 木瓜蛋白酶的酶解實驗 由表3可知,當酶添加量介于0～6000 U/g時,肽得率隨時間的延長逐漸升高,分別在4 h或5 h時達到最高值,之后維持穩定不再增加;當酶添加量為8000 U/g和10000 U/g時,肽得率隨時間的延長呈先升高后下降趨勢,分別在5 h或4 h時達到最高值。另一方面,肽得率隨著酶添加量的增加呈先升高后下降趨勢,這可能是因為酶添加量的增加導致酶解產物不斷積累,酶活性受到反饋抑制,導致酶解效率有所降低[20]。同時,隨著酶劑量的增加,水解效率大幅提高,肽得率到達高峰值的時間逐漸縮短,6000、8000、10000 U/g三種劑量分別在6、5、4 h時最高,分別高達25.40%、30.92%和28.53%。

當酶添加量介于0～4000 U/g時,水解度隨時間延長呈先升高后下降的趨勢,當酶添加量介于6000～10000 U/g時,水解度隨時間延長呈升高趨勢,在5 h或6 h時達到最高值;另一方面,水解度隨著酶添加量的增加也顯著升高,當酶添加量為10000 U/g時的水解度始終顯著(p<0.05)高于其余添加量,但過高劑量酶制劑會導致成本上升;當酶添加量為6000 U/g、水解6 h時的水解度也顯著(p<0.05)高于其它酶添加量的水解度,且與10000 U/g、6 h時水解度差異不顯著(p>0.05)。同時,水解度越高,平均肽鏈長度越小,相應的分子量越小。酶添加量為6000 U/g、酶解6 h時水解度高達15.82%,此時肽鏈長度為6.32,相應分子量約713.20,屬于小分子肽范疇[17]。

綜合考慮水解效果、酶制劑成本等因素,確定木瓜蛋白酶的適宜添加量為6000 U/g,酶解時間為6 h,此時所得酶解液澄清透亮、腥味最弱,感官質量最佳。

表3 木瓜蛋白酶添加量和酶解時間的篩選Table 3 Screening of the amount and time of enzymatic hydrolysis of papain

注：不同大寫字母表示相同酶添加量不同時間差異顯著(p<0.05);不同小寫字母表示同一時間不同酶添加量差異顯著(p<0.05)；表4同。

表4 風味酶添加量和酶解時間的篩選Table 4 Screening of the amount and time of enzymatic hydrolysis of flavor enzyme

2.2.2 風味酶的酶解實驗 由表4可知,當酶添加量介于0～4000 U/g范圍時,肽得率隨時間延長逐漸升高;當酶添加量介于6000～10000 U/g范圍時,肽得率隨時間延長呈先升高后下降趨勢;另一方面,肽得率隨著酶添加量的提高呈先升高后下降趨勢,當酶添加量在4000 U/g或6000 U/g時肽得率達到較高水平;酶添加量增至8000 U/g后,肽得率反而急劇下降至7%左右,這與木瓜蛋白酶變化趨勢基本一致。

從水解度角度而言,無論酶添加量多少,水解度均隨時間延長呈先增加后穩定的趨勢,隨酶添加量的增加呈逐漸升高趨勢,但添加量為4000 U/g和6000 U/g時的水解度差異始終不顯著(p>0.05)。從水解效果分析,盡管風味酶在添加量4000 U/g、時間為4 h條件下肽得率較高,之后隨時間延長肽得率變化不顯著(p>0.05);但結合4、5、6 h時的酶解液感官評價結果分析,較長時間的酶解反應有利于改善羊胎盤肽液的感官質量。因此,綜合考慮確定風味酶的適宜添加量為4000 U/g、適宜酶解時間為6 h。

2.3雙酶組合酶解實驗

由圖2可知,木瓜蛋白酶與風味酶無論同時添加(方案5)或分步添加(方案1～4),兩種酶的復合酶解效果均優于單酶作用,且同步復合酶解的方案5效果最好,肽得率和水解度均達到最高值,分別為37.08%和19.52%,比木瓜蛋白酶、風味酶單一酶解時的肽得率分別提高了31.50%和47.22%,水解度分別提高了18.95%和28.64%。因為木瓜蛋白酶屬于含巰基(-SH)肽鏈內切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有較廣泛的特異性,對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的酶解能力,風味酶起到調節風味的作用,將兩種酶組合可以對底物原料進行多位點作用,提高酶與底物的接觸頻率和作用位點,使其充分酶解,提高酶解效果[10]。因此,確定最優酶解組合方式為同時加入6000 U/g木瓜蛋白酶和6000 U/g風味酶,同步酶解12 h。

圖2 不同酶解方案的肽得率和水解度比較Fig.2 Comparison of the PY and DH for different enzymatic hydrolysis schemes

圖3 超聲時間對肽得率和水解度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the PY and DH

2.4超聲波預處理輔助酶解單因素實驗

2.4.1 超聲時間對酶解效果的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的增加,肽得率總體呈現先升高后降低的趨勢,20 min時肽得率達到最高值。因為隨著超聲輻射時間的延長,超聲波產生的空化效應逐漸增強,使胎盤蛋白質的空間結構發生變化,埋藏在蛋白質內部的活性部位暴露并與酶緊密作用。但時間過長會破壞胎盤組織細胞,反而會降低酶解產物的活性[21]。水解度隨著超聲時間的延長呈逐漸下降趨勢,但作用30 min時的水解度突然增加,原因可能是超聲時間過長導致胎盤組織細胞的大量內容物溶出,這與Jia[22]等研究結果一致。初步選擇超聲時間為20 min。

2.4.2 超聲溫度對酶解效果的影響 由圖4可知,在超聲時間范圍內,隨著溫度逐漸升高,肽得率和水解度均呈現先增加后減小趨勢,30 ℃時的肽得率最高,高達39.00%,該溫度時的水解度(21.04%)顯著(p<0.05)高于25 ℃(20.47%)、40 ℃(20.64%)、45 ℃(20.25%)和50 ℃(19.86%),但與35 ℃(20.87%)差異不顯著(p>0.05)。由于超聲處理可破壞蛋白結構,使蛋白的變性程度增加,適當溫度能使底物蛋白與酶作用位點更好接觸,但溫度過高會導致蛋白質變性過度,使可溶性蛋白含量下降[23-24],故初步選擇超聲溫度30 ℃。

圖4 超聲溫度對肽得率和水解度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the PY and DH

2.4.3 超聲功率對酶解效果的影響 由圖5可知,隨著超聲功率的增加,水解度變化總體呈先增后減趨勢,但超聲功率對肽得率影響無明顯變化規律。這可能是因為超聲處理過程中的熱效應作用使預處理體系的溫度升高,不同超聲功率對應的溫度增幅有較大差異,多重作用因素對酶解過程的肽得率構成不確定影響,這與彭彬[25]的研究結果一致。但考慮到功率為360 W時水解度最高達20.81%,此時對應的平均肽鏈長度最小(4.81),平均分子量約546左右,屬于小分子肽范疇,人體更容易消化吸收[17]。因此,初步選擇超聲功率為360 W。

圖5 超聲功率對肽得率和水解度的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the PY and DH

2.5響應面優化酶解工藝條件實驗

根據2.4中單因素實驗結果,以肽得率(Y)為響應值,進行超聲時間(A)、溫度(B)、功率(C)3個因素的參數優化。響應面設計方案與肽得率結果如表5所示,響應曲面圖如圖6所示。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析,建立二次響應面回歸模型:Y=37.356-0.6275A+0.2175B+0.6225C-0.29AB+0.275AC-0.425BC-3.5255A2-2.2955B2+4.0245C2。

表5 響應面實驗設計與結果Table 5 Experimental design and results of RSM

圖6 超聲時間、功率和溫度對肽得率影響Fig.6 Effect of ultrasonic time,power and temperature on the yield of peptide

表6 實驗結果方差分析表Table 6 Variance analysis of quadratic regression equation

注：復相關系數R=0.9687;離散系數CV=3.51%;*表示差異顯著(p<0.05)。

由表6模型方差分析可知,模型的F值為4.89(p<0.05),肽得率模型表現顯著;失擬項p值為0.2936(p>0.05),表現不顯著,復相關系數R為0.9687,說明該回歸方程擬合度良好,可用此模型對超聲波輔助酶解工藝進行分析和預測[26]。因子A、B和C及其交互項對肽得率影響不顯著(p>0.05),但其二次方A2、B2和C2對肽得率影響顯著(p<0.05)。超聲預處理的最佳參數條件為時間18.25 min、超聲溫度28.34 ℃、超聲功率405.95 W,該條件下肽得率和水解度的預測值分別為39.66%和21.69%。為便于實驗操作,將參數設置為時間18 min、溫度28 ℃、功率420 W進行3次平行驗證實驗,得到的肽得率平均值為39.89%,水解度平均值為21.78%,與預測值接近。與理論值相比,其相對誤差值分別為0.58%和0.41%,且重復性較好,結果可靠。計算得到該最優條件下胎盤肽的平均肽鏈長度為4.59,平均相對分子質量約500～600。

3 結論

響應面法優化后的羊胎盤超聲預處理最優參數為溫度28 ℃、功率420 W和超聲時間18 min,經超聲預處理后羊胎盤酶解的肽得率和水解度分別提高至39.89%和21.78%,制備得到了平均肽鏈長度4.59和平均相對分子質量500～600的小分子羊胎盤肽。說明超聲波輔助復合酶法制備羊胎盤肽的工藝可行,且效果明顯。

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OptimizationofpreparationofTibetansheepplacentapeptidebyultrasonic-assistedcompositeenzymatichydrolysis

ZHANGBing-yun1,WANGCong1,XIEYan-yan1,RENHai-wei1,*,FANWen-guang1,HUANGSi-yao1,LIZhi-zhong1,CHENWei2

(1.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China; 2.Lanzhou Mingde Agriculture-husbandry Technology Co.,Ltd.,Lanzhou 730010,China)

In order to realize the development and utilization of sheep placenta,the optimal combination scheme for the composite enzymatic hydrolysis of multiple proteases was investigated with the indicators of the yield of peptide(PY)and the degree of hydrolysis(DH). On this basis,the ultrasonic pretreatment parameters of sheep placenta were optimized by response surface methodology(RSM). The results showed that the optimal conditions of ultrasound pretreatment were found as follows:ultrasonic time of 18 min,temperature of 28 ℃and power of 420 W. Under these optimal ultrasound pretreatment conditions,synchronous composite enzymatic preparation by papain and flavor enzyme of the PY was 39.89%,the DH was 21.78%. And the average chain length was 4.59 and the molecular weight was about 500～600. Conclusion:the ultrasonic assisted enzymatic preparation method was feasible and effective in the preparation of Tibetan sheep placenta peptide.

Tibetan sheep;sheep placenta peptide;papain;flavor enzyme;ultrasonic pretreatment;process optimization

2017-03-22

張丙云(1968-),女,碩士,副教授,研究方向:食品科學,E-mail:zhang.b.y@163.com。

*

任海偉(1983-),男,博士,副教授,研究方向:食品科學,E-mail:rhw52571119@163.com。

甘肅省自然科學基金(1606RJZA206，1606RJYA287);蘭州市科技計劃項目(2014-2-20);蘭州理工大學紅柳青年教師培養計劃(Q201207)。

TS251.95

A

1002-0306(2017)21-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.027