釀酒黃水對枯草芽孢桿菌的抑菌機制研究

,,,,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.威海海洋職業學院食品工程系,山東威海 264300)

釀酒黃水對枯草芽孢桿菌的抑菌機制研究

盛杰1,2,紀海玉1,徐亞超1,劉安軍1,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.威海海洋職業學院食品工程系,山東威海 264300)

本論文以枯草芽孢桿菌為例,研究白酒發酵副產物黃水的抑菌機制。通過描繪細菌生長曲線,掃描電鏡觀察菌體表面形態,電導率實驗研究實驗菌細胞膜通透性,SDS-PAGE凝膠電泳觀察菌內蛋白變化,DAPI熒光染色觀察細菌核酸含量變化進行研究。結果證明:釀酒黃水處理的枯草芽孢桿菌生長曲線未出現明顯對數生長,掃描電鏡觀察菌體表面粗糙,電導率實驗證明釀酒黃水不能改變細胞膜通透性,SDS-PAGE凝膠電泳分析表明釀酒黃水可抑制菌內蛋白質合成,DAPI熒光染色結果表明釀酒黃水作用9 h后,枯草芽孢桿菌總DNA量減少30.39%,作用3 h后,RNA總量減少39.64%。因此,釀酒黃水抑菌機制主要通過抑制枯草芽孢桿菌菌體內蛋白質和核酸的合成實現的。

釀酒黃水,枯草芽孢桿菌,抑菌機理

食品的防腐保鮮一直是迫于解決的實際問題。一般而言,防腐劑可分為化學合成防腐劑和天然防腐劑,由于化學合成防腐劑的種類和應用范圍受到嚴格限制。因此,人們越來越關注從植物、動物、微生物中提取分離的天然防腐劑,它具有抑菌性強、抑菌譜廣、安全低等優點[1-2]。

白酒發酵副產物黃水是能源工業及釀酒業的副產品,產量大并且分布集中。在我國,釀酒黃水每年排放量高達6500多萬噸[3]。科學研究者常用釀酒副產物黃水生產醬油、勾調白酒、生產食醋等[4]。而本實驗室通過前期實驗證明,釀酒黃水對大多數細菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌等)和少部分真菌(青霉菌和曲霉菌)有很強的抑菌效果,也檢測到釀酒黃水含有小分子糖、有機酸、少量乙醇、揮發性物質,這與張曉磊[5]釀酒黃水副產物含有豐富氨基酸、維生素和多種微量元素相一致,因此,釀酒黃水作為一種天然的營養化防腐劑,應用于食品中是可行的。

目前有關釀酒黃一個新應用領域水抑菌及抑菌機理的研究較少[6-8],本論文擬對釀酒黃水的抑菌機理進行深入研究,通過菌株生長曲線變化、細胞微觀結構變化、膜通透性變化、菌體蛋白變化以及核酸含量變化初步探討釀酒黃水的抑菌作用途徑。研究結果為釀酒黃水作為新型天然防腐劑的開發應用提供實驗依據,促進其更有效的利用,除此之外,作為副產物,釀酒黃水的生產成本極低,作為天然防腐劑為推動國民經濟發展、實現更高經濟價值也起到一定作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒黃水 由江蘇大風歌酒業有限公司提供;EDTA、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、巰基乙醇、四甲基乙二胺 北京索來寶科技有限公司；以上試劑 均為分析純；枯草芽孢桿菌(Bascillussubtilis) 菌種均由天津科技大學食品工程與生物技術學院實驗室保藏。

但是，大豆的價格波動還會受到自然災害、制度等因素的影響，國際進出口的影響，尤其是現在的中美貿易戰，會在一定程度上影響大豆價格，本文并沒有分析完全，只是找出其中一部分影響因素來分析。因此，本文存在著一定的不足和需要改進的地方，這是以后研究的重點。

YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅有限公司醫療設備廠;JSM6380LV掃描電鏡 JEOL日本電子;NikonC1激光共聚焦顯微鏡 尼康有限公司;TI-U倒置熒光顯微鏡 尼康有限公司;F7000熒光分光光度計 日立高新技術公司;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;GIS-3500凝膠成像儀 Tanon公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種活化 將在-4 ℃條件下斜面保藏的菌體挑取一環,劃線于斜面試管固體培養基中,細菌在37 ℃下培養24 h備用[9]。

1.2.8 菌體DAN、RNA核酸含量變化的測定 取1 mL經釀酒黃水作用1、3、6、9、18 h的菌體樣液(OD600 nm=0.5),加入等體積DAPI染色液,振蕩10 min,后立即在熒光分光光度計下于DNA的激發波長364 nm和RNA的激發波長400 nm,測定菌體DNA和RNA的熒光強度,每組實驗重復三次,以磷酸緩沖液懸浮的菌體樣液作為對照[16]。

兼容問題會增大兒童坐姿不正確和緊急情況下受傷風險的幾率，而很多家長習慣用毛巾等其他物體綁在汽車座位上，這進一步增大了風險幾率。

從圖1可看出，對照組枯草芽孢桿菌在生長初期生長緩慢,隨后成對數生長,當培養18 h時,OD值達到最大;當加入釀酒黃水后,生長曲線發生明顯變化,存在顯著性差異(p<0.05)。生長曲線的差異說明釀酒黃水能減緩并最終抑制枯草芽孢桿菌的生長。

1.2.4 細菌微觀結構的測定 取生長到對數期的菌懸液,實驗組用釀酒黃水處理6 h,對照組加入磷酸緩沖液,各兩組。取樣時,共準備8個1.5 mL離心管。向每個小試管內加1.5 mL菌懸液,在4 ℃下,以7000 r/min離心5 min,棄去上清液體得菌體,pH6.8的磷酸緩沖液洗3次;戊二醛固定;30%、50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脫水各一次,每次4000 r/min離心20 min,再用濃度為100%的乙醇梯度脫水兩次;后放置于-80 ℃冰箱冷凍12 h,電鏡觀察細菌表面變化[11-12]。

1.2.5 細菌膜通透性的測定 將生長對數期的菌離心處理(4500 r/min,15 min),用0.02 mol/L,pH6.8的磷酸緩沖液洗3次;用釀酒黃水釋液體將菌體懸浮使其OD600 nm為0.2;以pH6.8磷酸緩沖液懸浮菌液作為空白,于37 ℃,170 r/min搖床中振蕩培養,分別于0、2、4、6、8、10 h,分別移取5 mL反應液離心(4500 r/min,15 min),并取上清液測電導率[13-14]。

應用SPSS 19.0統計學軟件分析本研究所有數據，計量資料的描述以均數±標準差表示，采用t檢驗或方差分析進行比較；計數資料的描述以率或構成比表示，采用卡方檢驗進行比較；生存曲線的繪制采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗，檢驗水準=0.05，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

1.2.6 細菌表達蛋白的測定 蛋白樣品制備:將生長對數期測試菌用0.02 mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液洗滌3次,實驗組做以下處理:取5 mL菌懸液與釀酒黃水充分混合:空白組取5 mL菌懸液體與5 mL、pH6.8、0.02 mol/L的磷酸緩沖液充分混合;兩組分別于170 r/min搖床中振蕩培養,分別于2、4、6、8 h時取樣2 mL(OD600 nm=0.5)并離心(8000 r/min,15 min),取沉淀并用無菌水充分洗滌離心(8000 r/min,15 min),加50 μL上樣緩沖液,充分混勻后于沸水浴中加熱10 min,再次離心后取15 μL上清液用于SDS-PAGE電泳[15]。

（1）建筑物臨邊防護管理：本工程施工現場所有的臨邊區域均設置防護欄桿，采用成型的φ48-51×3.5mm鋼管搭設。對于臨邊區域下放有人員通過的區域，還對欄桿進行了全面的安全網密封處理，避免墜物傷人。

從圖2可看出，實驗組枯草芽孢桿菌菌體表面在釀酒黃水處理6 h后表面粗糙,明顯看出有大顆粒物質與菌體表面結合;而對照組枯草芽孢桿菌菌體表面光滑;因此猜測釀酒黃水可能會影響到細菌的正常細胞代謝,從而起到抑菌的作用[17]。

1.2.2 制備菌懸液 將裝有玻璃珠及若干蒸餾水的50 mL三角瓶和裝有玻璃珠及9 mL蒸餾水的試管于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min,待用。已預先活化的供試菌種,用裝有無菌水的三角瓶制成菌懸液,于振蕩器振蕩30 min,使細胞打勻,用血細胞計數板鏡檢計數,之后用無菌水稀釋若干倍,配制成105～106CFU/mL菌懸液,均在24 h內使用[9]。

1.2.9 數據統計分析 每個樣品設三個平行,采用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進行數據分析,測定結果以平均值±標準差表示。實驗數據采用ANOVA進行鄧肯氏差異分析,以p<0.05為差異顯著。

《規范》第3章針對不同性質的防護區域應采用的系統類型、泵組所負擔的系統噴頭數量、系統噴霧強度、噴頭工作壓力、噴頭安裝高度等均有新的規定。對方案產生較大影響的條文主要包括第3.1.3條、3.4.2條、3.4.3條、3.4.4條、3.4.5條和3.4.10條等，除第3.1.3條外，其他幾條的描述中基本都采用了“應”。具體條文及相關分析詳見表2。

2 結果與分析

2.3釀酒黃水對細菌膜通透性的影響

1.2.3 菌種生長曲線的測定 取24個試管,分A和B兩組,每支15 mL;試管分別加入5 mL液體培養基,并加入100 μL上述菌懸液,放入37 ℃,170 r/min搖床進行振蕩監控培養,每隔2 h對A和B組分別取4 mL樣品在600 nm下測其吸光值,其中8 h取樣測量后A組加入抑菌目標物質樣液,B組加入pH6.8的磷酸緩沖液作為對照,繼續培養,直至培養22 h結束監測。以培養時間為橫坐標、以培養液OD600 nm為縱坐標描點繪圖[10]。

式中φi代表載波相位，Ri為接收機到衛星的距離，Ii為電離層誤差，Ti為對流層誤差，c表示光速，δtr表示衛星鐘差，δts表示接收機鐘差，Oi表示衛星軌道誤差，Mi表示多路徑、接收機噪聲等測量誤差，λ為波長，N為整周模糊度。

圖1 釀酒黃水作用下枯草芽孢桿菌與正常組的生長曲線比較Fig.1 Contrast of Bacillus subtilis growth curves between normal and affected by yellow water注:(CK)對照組枯草芽孢桿菌,(CBH)釀酒 黃水處理組,圖2、圖3同,圖5～圖7同。

2.2釀酒黃水對細菌微觀結構的影響

1.2.7 釀酒黃水對枯草芽孢桿菌菌體熒光強度變化的檢測 將培養至對數期的菌,離心處理(4500 r/min,15 min),并用0.02 mol/L的磷酸緩沖液洗滌3次;用釀酒黃水將菌體懸浮使其OD600 nm為0.5,等量的磷酸緩沖液懸浮的菌液作為空白對照,于37 ℃,170 r/min搖床中振蕩培養,培養3 h后,在載玻片上滴加1 mL的DAPI染色液和菌體樣液(OD600 nm=0.5),混勻后在黑暗中靜置10 min,在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照[16]。

圖2 掃面電子顯微鏡下枯草芽孢桿菌的形態變化Fig.2 The metamorphic of structure of Bacillus subtilis under scanning electron microscope

2.1釀酒黃水對細菌生長曲線的影響

知識內化則主要以課堂教學為主，老師可以結合學生刻苦學習的實質情況，針對學生所存在的不足進行有效的輔導。因此，翻轉課堂能夠有效地促進學生課前預習時間的延長，在完成主體教學之后，學生可以在課外觀看不同的視頻，采取不同的手段和途徑查閱相關的教學資料和學習資料，對個人所學習的知識進行進一步的鞏固。老師則可以結合學生作業完成的實質情況對學生的知識點進行有效的檢驗，以此來為后續教學活動的開展提供更多的依據。

從圖3可看出,實驗組枯草芽孢桿菌菌懸液加入釀酒黃水后,與空白對照組相比,存在顯著性差異(p<0.05)。起初,電導率立刻高于對照組,這可能是釀酒黃水中本身含有小分子糖、有機酸,在自身環境下本身帶正電荷的原因,當處理6 h后,兩組電導率幾乎相等,之后,隨著時間的延長實驗組電導率值一直低于對照組,其原因猜測是釀酒黃水沒有破壞枯草芽孢桿菌的細胞膜,而是與細胞膜外表面發生了某種靜電結合,從而導致帶電離子的減少,使培養液總的電導率降低,影響細菌的正常代謝,起到抑菌的作用[18-19]。

在水平井的實際鉆探過程中，復合鉆進和定向鉆進交叉進行，導致平均鉆時較大，從而造成10m的鉆進時間通常要比一個巖屑遲到時間大，從表2可以看出，地質錄井資料相比遠鉆頭地質導向測量數據更具時效性。而地質錄井資料的滯后性可通過循環的方式完整獲得，而遠鉆頭地質導向測量數據無法通過循環獲得井底數據。

圖3 釀酒黃水作用下枯草芽孢桿菌與正常組的電導率比較Fig.3 Contrast of Bacillus subtilis conductivity between normal and affected by yellow water

2.4釀酒黃水對細菌表達蛋白的影響

從圖4可看出,釀酒黃水作用后的枯草芽孢桿菌菌體蛋白電泳譜帶,與對照組蛋白電泳譜帶比較呈現明顯差別:對照組的菌體譜帶隨時間的延長,譜帶加深。而釀酒黃水作用后,隨時間的延長蛋白譜帶明顯變淺,這進一步說明釀酒黃水中部分成分抑制了枯草芽孢桿菌菌體某些蛋白的合成,導致細菌胞內蛋白的下降[20]。

圖4 釀酒黃水對枯草芽孢桿菌菌體蛋白的影響Fig.4 Effect of yellow water on protein of Bacillus subtilis注:條帶1～4分別為4 h對照、 4 h實驗、8 h對照、8 h實驗組。

2.5釀酒黃水對菌體核酸的影響

2.5.1 釀酒黃水對菌體熒光強度的影響 DAPI是一種能夠與DNA和RNA結合的熒光染料,核酸量越大,熒光亮度越強。通過倒置熒光顯微鏡觀察,DAPI可以穿過細胞膜進入細胞的內部,并與核酸穩定結合。釀酒黃水作用枯草芽孢桿菌3 h后的熒光顯微鏡觀察結果如圖5所示,可知,對照組熒光強度明顯高于實驗組,這是由于釀酒黃水中抑菌成分抑制了菌體核酸的合成,使得實驗組核酸含量要明顯低于對照組[21]。

圖5 釀酒黃水對枯草芽孢桿菌熒光顯微圖的影響Fig.5 Effect of yellow water on DAPI stained of Bacillus subtilis

2.5.2 釀酒黃水對菌體DNA、RNA含量的影響 經釀酒黃水作用后,枯草芽孢桿菌的核酸含量明顯減少,兩組之間存在顯著性差異(p<0.05)。其中作用9 h后菌體的DNA含量如圖6所示,比對照組減少了30.39%,作用3 h后RNA含量變化,如圖7所示,其含量與對照組相比減少了39.64%,這說明釀酒黃水可以阻礙枯草芽孢桿菌核酸的合成。

圖6 釀酒黃水對枯草芽孢桿菌DNA含量的影響Fig.6 Effect of yellow water on synthesis of DNA on Bacillus subtilis

圖7 釀酒黃水對枯草芽孢桿菌RNA含量的影響Fig.7 Effect of yellow water on synthesis of RNA on Bacillus subtilis

3 結論

白酒發酵副產物黃水可以明顯抑制枯草芽孢桿菌的生長。生長曲線實驗表明,經釀酒黃水處理后,枯草芽孢桿菌的生長曲線發生了明顯變化;掃描電鏡觀察,經釀酒黃水處理后,菌體表面粗糙而對照組菌體表面光滑;電導率實驗表明釀酒黃水不能改變細胞膜通透性;SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，釀酒黃水可抑制枯草芽孢桿菌菌內蛋白質的合成,使菌體內蛋白質總量隨作用時間的延長呈下降趨勢;DAPI熒光染色結果顯示,釀酒黃水可明顯抑制核酸的合成。因此,釀酒黃水具有較強的抑菌活性,主要是通過抑制枯草芽孢桿菌蛋白質和核酸的合成實現抑菌的。

[1]段麗麗.新型天然抗菌試劑研究進展[J].中國調味品,2016,27(3):162-165.

[2]鄧浩,尹青春,謝桂勉,等.天然食品防腐劑的研究和開發利用[J].輕工科技,2014(6):30-33.

[3]馮興垚,鄧杰,謝軍,等.白酒酵造副產物黃水綜合利用現狀淺析[J].中國釀造,2017,37(2):41-44.

[4]王媚,傅小紅,馮學愚,等.不同預處理方式對氣相色譜檢測黃水揮發性組分影響的研究[J].食品與發酵科技,2015(10):90-92.

[5]張曉磊,史潛玉,王化斌,等.白酒釀造副產物黃水中揮發性化合物的研究[J].釀酒,2010,37(2):41-44.

[6]Zhu Shunying,Yang Yang,Yu Huaidong,et al.Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Chrysanthemum indicum[J].Ethnopharmacol,2005,96(1):151-158.

[7]Sperotto R M,Moura D J,Peres V F,et al.Cytotoxic mechanism of essential oil and its major compound nerolidol[J].Food and Chemical Toxicology,2013,57:57-68.

[8]Burt S.Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods:a review[J].International Journal Food Microbiology,2004,94(3):223-253.

[9]劉慧.現代食品微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工業出版社,2017:35-37.

[10]楊紅.生物化學實驗指導[M].北京：中國醫藥科技出版社，2016:35-37.

[11]王磊.食品分析與檢驗[M].北京：化學工業出版社,2017.

[12]周德慶.微生物學教程[Z].北京:高等教育出版社,2011.

[13]Park C B,Yi K S,Matsuzaki K,et al.Structure-activity analysis of buforin II,ahistone H2A derived antimicrobial peptide:thproline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(15):8245-8250.

[14]Subbalakshmi C,Sitaram N.Mechanism of antimicrobial action of indolicidin[J].FEMS Microbiol Lett,2008,160:91-96.

[15]Fabbretti A,Brandi L,Petrelli D,et al.The antibiotic furvina argets the Psite of 30s ribosomal subunits and inhibits translation initiation displaying start codonbias[J].Nucleic Acids Research,2012,40(20):10366-10374.

[16]Fabbretti A,Brandi L,Petrelli D,et al.The antibiotic furvina argets the Psite of 30s ribosomal subunits and inhibits translation initiation displaying start codonbias[J].Nucleic Acids Research,2012,40(20):10366-10374.

[17]Zhu Shunying,Yang Yang,Yu Huaidong,et al.Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Chrysanthemum indicum[J].Ethnopharmacol,2005,96(1):151-158.

[18]Sperotto R M,Moura D J,Peres V F,et al.Cytotoxic mechanism of essential oil and its major compound nerolidol[J].Food and Chemical Toxicology,2013,57:57-68.

[19]Burt S.Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods:a review[J].International Journal Food Microbiology,2004,94(3):223-253.

[20]Shao X,Cheng S,Wang H,et al.The possible mechanism of antifungal action of tea tree oil on Botrytis cinerea[J].Journal of Applied Microbiology,2013,114:1642-1649.

[21]Patrzykat A,Friedrich C L,Zhang L,et al.Sublethal concentrations of pleurocidinderived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli.Antimicrob[J]. Agents Chemother,2002,46:605-614.

權威·核心·領先·實用·全面

Studyonanti-bacterialmechanismofyellowwaterfromliquorfermentationonBacillussubtilis

SHENGJie1,2,JIHai-yu1,XUYa-chao1,LIUAn-jun1,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457，China;2.Department of Food Engineering,Weihai Ocean Vocational College,Weihai 264300，China)

The antibacterial mechanisms of yellow water from liquor fermentation were studied withBacillussubtilisused as the experimental strain. Growth curve ofBacillussubtilis,the surface of the bacteria by means of the scanning electron microscope,the test of the conductivity ofBacillussubtilis,bacterial protein synthesis by SDS-PAGE,fluorescence microscopy and fluorescence spectrophotometer were used to investigate the antibacterial mechanism of yellow water. The resulted indicated that the yellow water could inhibit the logarithmic growth ofBacillussubtilis. The surface of the bacteria treated with yellow water was rough by means of the scanning electron microscope,while the surface of the bacteria in control group was smooth. Yellow water could not change the bacterial membrane permeability by the test of the conductivity ofBacillussubtilis. Yellow water could inhibit bacterial protein synthesis by SDS-PAGE and the band ofBacillussubtiliswith yellow water turned lighter. Fluorescence microscopy and fluorescence spectrophotometer results showed that DAPI integrated withBacillussubtilisand the quantity of DNA after treated with yellow water for 9 h and RNA after treated with yellow water for 3 h were reduced by 30.39% and 39.64% respectively. The results showed that yellow water from liquor fermentation could inhibit the growth of bacteria significantly,the mechanisms of the inhibition activity may include inhibiting synthesis of nucleic acid and protein.

yellow water from liquor fermentation;Bacillussubtilis;antibacterial mechanisms

2017-04-11

盛杰(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：功能性食品的研究與開發，E-mail：270450819@qq.com。

*

劉安軍(1963-)，男，博士，教授，研究方向：功能性食品的研究與開發，E-mail：laj@tust.edu.cn。

省部級農業部項目(201303082-3)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0126-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.026