單一干酪乳桿菌KL1發酵益生菌酸奶工藝條件的研究

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(北京農學院食品科學與工程學院,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室, 食品質量與安全北京實驗室,微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室,北京 102206)

單一干酪乳桿菌KL1發酵益生菌酸奶工藝條件的研究

張敏,張子豪,康建依,劉慧,謝遠紅,易欣欣,高秀芝*

(北京農學院食品科學與工程學院,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室, 食品質量與安全北京實驗室,微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室,北京 102206)

應用單因素實驗及正交實驗,確定單一干酪乳桿菌KL1發酵酸奶的最佳原料乳,并對其益生菌酸奶發酵工藝條件進行優化。篩選得到的最佳原料乳為M2,同時通過添加M6改善酸奶的色澤與組織狀態;采用三因素三水平L9(34)正交實驗優化酸奶的發酵工藝條件,接種量是影響KL1發酵酸奶品質的最主要因素,確定干酪乳桿菌KL1發酵酸奶的優化條件如下:接種量為6.0%,M6添加量1.0%,葡萄糖添加量1.5%,37 ℃下發酵酸奶22 h,優化后的益生菌酸奶的活菌數量較對照組高10倍。

益生菌酸奶,干酪乳桿菌KL1,正交實驗,感官評定

益生菌(Probiotics)是一類對宿主有益的活性微生物,是定植于人體腸道、生殖系統內,能產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡、發揮有益作用的活性有益微生物的總稱。人體、動物體內有益的細菌或真菌主要有:酪酸梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、放線菌、酵母菌等[1]。益生菌具有良好的降低血清膽固醇[2]、促進腸道消化系統健康[3]、提高人體免疫力[4]等作用已經逐漸成為國際上的熱門研究課題。乳制品尤其以酸奶為代表的發酵乳制品是益生菌最佳的載體之一。目前國內常用的酸奶主要是利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發酵生產,該產品對人體胃腸酸環境耐受性較差,酸奶進人胃腸道后,成活率僅有0.065%和0.01%[5]。研究表明,在發酵乳制品中添加益生菌,除了保健功能外,還可改善發酵乳的風味和質地[6]。

干酪乳桿菌KL1來源于藏靈菇,該菌具有調節人體腸道酸堿度從而改善腸道中微環境的作用,還具有抗腫瘤、降血清膽固醇、增強人體免疫力等多種生理功能[7-9]。劉慧等[10]對干酪乳桿菌KL1中產膽鹽水解酶乳酸菌降膽固醇作用機理方面的研究做出了突出貢獻,郭志華等[11]對干酪乳桿菌KL1的益生特性做出進一步研究,張晶等[12]利用干酪乳桿菌KL1和乳酸菌制成降膽固醇蛋乳發酵飲料,張倩[13]等將其干酪乳桿菌KL1作為酸奶發酵劑進行分批發酵,但將單一干酪乳桿菌KL1直接用于發酵酸奶的研究尚未見文獻報道。

因此,本研究以單一益生菌——干酪乳桿菌KL1作為發酵菌種,以感官評定指標、活菌數指標以及酸度等作為評價指標,應用不同品牌的原料乳發酵制備酸奶,以及確定KL1發酵酸奶的最佳原料乳;其次通過正交實驗優化干酪乳桿菌KL1發酵益生菌酸奶的工藝條件。本研究將為干酪乳桿菌KL1的工業化生產提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種 干酪乳桿菌KL1來源于實驗室保藏菌種,-80 ℃凍存；原料 9種不同品牌原料乳或乳粉樣品,分別編號為M1(三元極致低脂純牛奶)、M2(三元純牛奶)、M3(歐德堡超高溫滅菌脫脂牛奶)、M4(歐德堡超高溫滅菌高脂牛奶)、M5(伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉)、M6(伊利全脂甜奶粉)、M7(伊利純牛奶)、M8(蒙牛高鈣牛奶)、M9(蒙牛低脂高鈣牛奶),其中M5和M6為乳粉；白砂糖、葡萄糖、NaOH、酚酞、MRS培養基、瓊脂等；原料乳、乳粉及白砂糖 均購于超市,其它試劑 購于北京暢華志誠科技有限公司；培養基 改良MRS培養基[13](將MRS培養基中的魚蛋白胨以0.5%的胰蛋白胨和0.5%乳酪蛋白水解物替代,其他成分不變),滅菌脫脂乳等。

MLS-3750全自動高壓滅菌鍋 日本三洋公司;GHP-9160型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;BS224S型精密電子天平 德國賽多利斯公司;BCD-301型冰箱 青島海爾股份有限公司;電磁爐 廣東美的集團股份有限公司;BCN-1360B型無菌超凈工作臺 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;Scientz-11L 無菌均質器 寧波新芝生物科技有限公司;PHB-4便攜式酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌種活化及發酵劑制備 先用改良MRS液體培養基活化干酪乳桿菌KL1,37 ℃培養18 h,然后將干酪乳桿菌KL1以3%的接種量接種于裝有10 mL滅菌牛奶的試管中,振蕩搖勻,于37 ℃培養至牛乳成凝固狀態。如此傳代培養至第3次,得到活化菌種,冷藏備用。

1.2.2 酸奶發酵單因素實驗

1.2.2.1 發酵制備酸奶樣品 分別將9種原料(m乳粉∶m水為1∶5復溶)經115 ℃殺菌15 min,加5%的白砂糖,冷卻至42 ℃后接入4%干酪乳桿菌KL1發酵劑。分裝,于37 ℃下培養22 h[14-15],轉移至4 ℃冰箱中冷藏。將9種酸奶分別編號為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9。

1.2.2.2 酸奶中干酪乳桿菌KL1計數 分別取25 mL酸奶樣品于225 mL滅菌生理鹽水中,充分混勻,制成10-1的樣品稀釋液。取10-1樣品液1 mL,沿管壁緩慢注于9 mL稀釋液中,混合均勻,制成10-2的樣品液,并依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度的樣品液。

分別取10-7、10-8、10-9稀釋度的樣品液1 mL,傾注MRS平板。每個梯度做3個平行,同時做空白對照。待瓊脂凝固后,37 ℃倒置培養48 h,選取無蔓延菌落生長的平板用于計數,參照GB 4789.35-2010記錄并計算Y1～Y9酸奶的干酪乳桿菌KL1菌數[16]。

1.2.2.3 酸奶的酸度測定 pH的測定:取各酸奶樣品25 g,加入225 mL蒸餾水,混勻后,用pH計測定其pH。酸度的測定[17]:取各酸奶樣品10 mL于150 mL三角瓶中,再加入20 mL蒸餾水和0.5 mL的0.5%酚酞溶液,搖勻,用0.1 mol/L(近似值)氫氧化鈉溶液滴定至微紅色,并在30 s內不褪色為止,記錄0.1 mol/L(近似值)氫氧化鈉所消耗的毫升數(A)。兩次平行實驗結果差值不得大于0.5°T。

吉爾涅爾度(°T)=A×F×10

式(1)

式(1)中:A-滴定時消耗的0.1 mol/L(近似值)氫氧化鈉的毫升數;F-0.1 mol/L(近似值)氫氧化鈉的校正系數;10-酸奶的稀釋倍數。

1.2.2.4 酸奶的感官評價 酸奶感官評定小組為專業的評價人員構成,共有15人。采用描述性的檢測方法分別對樣品的組織狀態、口感、氣味和色澤進行細致的描述,評分標準采用百分制[17]。以感官評價的結果作為酸奶的評定標準,酸奶感官評定表如表1所示。

表1 酸奶感官評定表[19]Table 1 Yogurt sensory evaluation table[19]

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.2.5 最佳原料乳的確定 綜合9種酸奶的活菌數、酸度以及感官評價的結果,確定最佳干酪乳桿菌KL1發酵酸奶的原料乳。

1.2.2.6 單因素酸奶發酵實驗 應用1.2.2.5確定的原料乳,經115 ℃殺菌15 min,加5%的白砂糖,冷卻至42 ℃后,分裝,乳粉M6添加可改善酸奶的色澤與組織狀態,單因素實驗考察接種量、葡萄糖添加量與M6添加量三個因素對酸奶發酵的影響:固定M6添加量1.0%與葡糖糖添加量1.0%,考察不同KL1接種量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%)對酸奶感官品質的影響;固定M6添加量1.0%與接種量4.0%,考察不同葡萄糖添加量(0.5%、1%、1.5%、2%)對酸奶感官品質的影響;固定接種量4.0%與葡糖糖添加量1.0%考察不同M6添加量(0.5%、1%、1.5%、2%)對酸奶感官品質的影響。

1.2.3 酸奶發酵正交實驗 基于該菌種的前期研究結果[14-15],在37 ℃條件下,干酪乳桿菌KL1可以高產胞外多糖和膽鹽水解酶,牛乳凝固作為酸奶發酵的終止標志,因此本實驗不再針對培養溫度37 ℃和發酵時間進行發酵條件的優化。結合單因素實驗結果,對接菌量、M6添加量以及葡萄糖添加量等影響因素進行正交實驗分析,采用L9(34)正交實驗設計,正交實驗因素水平選擇見表2,每組實驗重復3次。對正交實驗得到的酸奶分別進行酸度測定、感官評價以及活菌菌數測定。

正交實驗驗證實驗中,普通發酵條件組合設為對照組,正交實驗得到的感官指標優化組、活菌數量指標優化組以及正交實驗感官最佳組作為驗證組,驗證比較酸奶最佳發酵條件的優越性。

1.3數據處理

利用Excel 2007和SPSS 18分析軟件對數據進行統計分析,并結合Duncan氏法做多重比較,所有實驗均重復三次,結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1干酪乳桿菌KL1發酵酸奶樣品中活菌數量、酸度及pH

干酪乳桿菌KL1發酵原料乳樣品制備酸奶,9種酸奶樣品活菌數量、酸度及pH測定結果如表3所示,9種酸奶益生菌的活菌數量均在8.0 log CFU/g以上,其中Y2和Y6酸奶活菌數量顯著高于其它7種酸奶的活菌數量,活菌數量達到9.0 log CFU/g以上,根據統計數據分析Y2與Y6與其他7種樣品之間存在顯著性差異(p<0.05),由數據可以看出Y2的活菌數量又高于Y6的活菌數量,在9種酸奶中活菌數量最高為9.27 log CFU/g;9種酸奶中,Y2和Y6的酸度明顯低于其它7種酸奶。酸奶發酵的終止酸度越高,其酸化速度越快,保質期相對縮短,不利于酸奶的長時間儲藏,故Y2和Y6的酸度適中,且保質期相對與其它7種酸奶樣品更長;從酸奶的pH來看,雖然Y5的pH與其他8種樣品酸奶的pH之間存在顯著性差異,但由于Y5樣品的活菌數量低于Y2和Y6,酸度大于Y2和Y6,而9種酸奶的pH在4～5之間,所以綜合考慮Y2和Y6要優于Y5。

表3 酸奶中活菌數量、酸度及pHTable 3 Cells of lactic acid bacteria,acidity and pH of yogurt

注：用Duncan法進行多重比較；同列標有不同字母者表示組間差異顯著(p<0.05);標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(p>0.05)；表4同。

2.2干酪乳桿菌KL1發酵酸奶樣品感官評定結果

如表4所示,雖然采用相同發酵菌種,但不同原料乳樣品發酵后得到的益生菌酸奶感官評定指標得分不同。其中Y2和Y6酸奶樣品感官評定單個指標得分和感官評定總分均明顯高于其它幾種酸奶,而酸奶的口感指標與組織狀態指標相比其它兩個評定指標更為重要,9種酸奶樣品中口感指標Y2得分最高,通過統計學分析得出Y2與Y6在口感方面與其他幾種樣品酸奶具有顯著性差異(p<0.05)。組織狀態指標Y6得分最高,通過統計學分析得Y6與其他8種樣品之間存在顯著性差異(p<0.05),但是M6是原料乳粉,相比原料乳來說成本高[17],酸奶發酵工藝相比原料乳還要增加復水步驟。

綜合干酪乳桿菌KL1發酵酸奶的活菌計數結果、酸度、pH以及感官評定結果,最終選擇M2為最佳原料乳樣品,同時通過添加M6來彌補其在色澤以及組織狀態方面的不足。

表4 酸奶感官評定結果Table 4 Results of sensory evaluation of yogurt

2.3干酪乳桿菌KL1發酵酸奶單因素實驗

干酪乳桿菌KL1的接種量對酸奶感官品質的影響如圖1所示,在接菌量為2.0%～6.0%之間,隨著接菌量的增加,所制酸奶的感官評分越高,但當接菌量為8.0%時,酸奶的感官評分下降,酸奶出現結塊現象,同時有大量的乳清析出,進而影響感酸奶官評定的分數,由實驗結果得出,接菌量為6.0%時酸奶感官品質最佳。

圖1 不同接種量對酸奶感官品質的影響Fig.1 Effect of different inoculation amount on sensory quality of yoghurt

不同葡萄糖添加量對酸奶感官品質的影響結果如圖2所示,在葡萄糖添加量為1.5%時,感官評分70分,較其它添加量略高,當葡萄糖的添加量達到2%時,感官評分最低,出現下降的原因是添加2%的葡萄糖所制成的酸奶甜度增大,影響酸奶的口感,由實驗結果得出,葡萄糖添加量為1.5%酸奶感官品質最佳。

圖2 不同葡萄糖添加量對發酵酸奶感官品質的影響Fig.2 Effect of different glucose content on sensory quality of yoghurt

不同M6添加量對酸奶感官品質的影響結果如圖3所示,M6的添加在0.5%～1.5%范圍時,可以改善酸奶組織狀態和感官品質,但隨著奶粉添加量不斷的增加,對感官品質也會產生不良的影響,主要表現為所制備的酸奶具有更濃的奶香味,影響了酸奶本身的風味,由實驗結果得出,M6添加量為0.5%時酸奶感官品質最佳。

圖3 不同M6添加量對發酵酸奶感官品質的影響Fig.3 Effect of different M6 content on sensory quality of yoghurt

2.4干酪乳桿菌KL1發酵酸奶正交實驗

干酪乳桿菌KL1發酵酸奶正交實驗結果如表5所示,從感官評定指標看,影響程度由強到弱依次為接種量>葡萄糖添加量>M6添加量,最優發酵條件為A3B2C3,即接種量6.0%、M6添加量1.0%、葡萄糖添加量1.5%。菌株KL1發酵酸奶條件中,對活菌數量的影響程度由強到弱依次為接種量>葡萄糖添加量>M6添加量,最優發酵條件為A3B2C1,即接種量6.0%、M6添加量1.0%、葡萄糖添加量0.5%。

表5 干酪乳桿菌KL1發酵酸奶正交實驗結果Table 5 Results of Lactobacillus casei KL1 fermented yogurt orthogonal experiment

表6 發酵條件的優化前后比較Table 6 Comparison of fermentation conditions before and after optimization

2.5驗證實驗

如表6所示,從對照組、感官指標優化組A3B2C3、活菌數量指標優化組(正交實驗活菌數量最佳組)A3B2C1以及正交實驗感官最佳組A3B3C3比較結果來看,感官指標優化組A3B2C3,即接種量6%、葡萄糖添加量1.5%、M6添加量1.0%條件下進行酸奶發酵,酸奶活菌數量達9.84 log CFU/g,相比對照組高10倍,感官評定總分為96分,這兩個指標均高于其它幾組;從酸度來看A3B2C3組合條件下制備的酸奶酸度適宜。干酪乳桿菌KL1發酵的酸奶口感細膩、綿滑、黏稠、均勻,香氣濃郁。本研究優化后發酵酸奶活菌數量與Gorissen的研究相比,活菌數量和酸奶感官品質與之相當,可以替代進口益生菌功能性酸奶[18-21]。

3 討論

國內市場酸奶種類繁多,但國內尚無利用改善腸道微環境、抗腫瘤、降血清膽固醇、增強人體免疫力等多種生理功能的益生菌酸奶[18]。藏靈菇源干酪乳桿菌KL1具有高產胞外多糖和膽鹽水解酶等活性物質的功能[8],以此菌種作為單一的酸奶發酵菌種發酵生產酸奶,可以填補改善腸道微環境、抗腫瘤、降血清膽固醇、增強人體免疫力等功能性酸奶市場的空白。利用干酪乳桿菌KL1發酵生產的酸奶與普通發酵劑發酵生產的酸奶相比較,雖然在活菌數量以及感官評定方面均達到較高的水平,但該酸奶在貯藏期間產品品質變化以及產品的貨架期還需要做進一步的實驗研究。

4 結論

原料乳M2為干酪乳桿菌KL1的最佳原料乳樣品,同時通過添加乳粉M6來改善在色澤以及組織狀態方面的不足。

萄葡糖添加量是影響干酪乳桿菌KL1發酵酸奶感官評定指標和活菌數量指標的最主要因素,接菌量稍次之,而奶粉添加量對感官評定和活菌數量的影響最小,即影響酸奶感官和活菌數量的影響因素順序為接菌量>葡萄糖添加量>M6添加量。

采用三因素三水平L9(34)正交實驗,確定干酪乳桿菌KL1發酵酸奶的優化組合是接種量為6.0%,M6添加量1.0%,葡萄糖量1.5%,在優化條件下進行發酵酸奶,酸奶的活菌數量較對照組高10倍。

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StudyonthefermentationconditionsofprobioticsyogurtwithsingleLactobacilluscaseiKL1

ZHANGMin,ZHANGZi-hao,KANGJian-yi,LIUHui,XIEYuan-hong,YIXin-xin,GAOXiu-zhi*

(Faculty of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development,Beijing 102206,China)

Based on the single factor and orthogonal experiment,the optimal pure raw milk and fermentation conditionsLactobacilluscaseiKL1 fermented yogurt were determined. The optimized screening of raw milk was M2,at the same time by adding milk powder(M6)to improve color and structure of yogurt. Using three factors and three levels of L9(34),the optimization of fermentation process of yoghurt orthogonal experiment,inoculation amount was the main factor affecting the quality of yoghurt fermentation KL1,the following optimized conditions ofLactobacilluscaseiKL1 fermented yogurt determined that the inoculation rate was 6.0%,the amount of M61.0%,glucose 1.5%,37 ℃ for 22 h,the number of viable bacteria in probiotic yogurt was about 10 times as high as that of the optimized yogurt before the fermentation.

probiotic yogurt;LactobacilluscaseiKL1;orthogonal experiment;sensory evaluation

2017-03-22

張敏(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail: 2317909305@qq.com。

*

高秀芝(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物與生物技術，E-mail:gxz@bua.edu.cn。

2016年北京農學院協同創新建設項目；北京市葉類蔬菜產業創新團隊(BAIC07-2017)。

TS252.54

A

1002-0306(2017)21-0104-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.022