基因組改組快速提高日本小球藻脂肪產量

, ,,,, ,,

(廣西民族大學海洋與生物技術學院/廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地,廣西南寧 530007)

基因組改組快速提高日本小球藻脂肪產量

劉紅全,袁莎,盧恩秋,潘藝華,楊海燕,龍寒,禤金彩,何秀苗

(廣西民族大學海洋與生物技術學院/廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地,廣西南寧 530007)

以日本小球藻為出發藻株,經過紫外線和甲基磺酸乙酯分別誘變處理,獲得4株總脂產量有所提高的突變株。以聚乙二醇作為融合劑,對獲得的突變株進行兩輪遞歸式原生質體融合,篩選到遺傳穩定的改組藻株F2C2,其總脂含量為59.01%,較原始藻株提高了101.4%。對日本小球藻的原始藻株和改組藻株F2C2的油脂含量進行分析,結果表明改組前后日本小球藻的總脂組成成分沒有變化,但各組分含量有較大差別。

基因組改組,總脂含量,日本小球藻

隨著全球經濟發展以及人口的快速增長,為降低化石能源資源的消耗,減少對環境的損害,尋求可再生的環境友好型能源已成為當務之急[1]。微藻由于其細胞結構簡單、繁殖速率快、含油量高等特性,是生產生物乙醇的理想原料,成為第三代生物能源的典型代表。開發微藻生物乙醇具有廣闊的發展前景[2]。目前,限制微藻油脂產業化的主要障礙是成本較高,養殖效率遠低于理論預期。其根本原因是現有藻種無法滿足生產的需要,現有的種子一般是直接從野生環境中篩選出來,最多進行了初步的馴化改良,其農藝性狀遠不能滿足大規模養殖的需要，生產性栽培需要高密度,高光效,高含油量,高抗病,高抗蟲,對環境溫度、pH、鹽濃度的變化也要有較強的適應性的品種,才能高產穩產,提高產出。因此,培育高產穩產優質的新品種是微藻產業化的關鍵。

基因組改組技術是一種新的體內分子育種方法,利用遞進式遺傳重組模擬了微生物自然進化過程,通過多親本之間的全基因組的融合重組,將優良性狀組合在一起,能在短時間內大幅度提高微生物細胞的表型,是近來極受關注的育種新技術。雖然基因組改組技術的育種效果顯著,并且已有一些成功應用的實例[3-5],但利用基因組改組技術對微藻進行定向改造,目前尚未見報道。本文利用基因組改組技術對富含油脂的日本小球藻進行選育,進一步提高其油脂產率,為小球藻油脂工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

日本小球藻(Chlorellahirataii) 購自上海光語公司，將微藻按照10%的接種量培養于含250 mL的F/2培養基的500 mL三角瓶中培養。人工氣候箱的培養條件為光照強度3500 lux,暗光周期為12 h/12 h,培養溫度為(24±1) ℃,每日搖動3～4次;甲基磺酸乙酯(EMS)、半纖維素酶(0.3～3.0 U/mg),果膠酶(400～800 U/g) 美國Sigma公司;纖維素酶(≥0.3 U/mg) Solarbio公司;其他試劑 國產分析純;再生培養基:新鮮的F/2海水培養基中添加0.2 mol/L甘露醇,固體培養基另加0.8%～1.0%的瓊脂。

ZHJH-C1112B超凈工作臺 上海智誠分析儀器公司;BG-01超聲水浴鍋 廣州邦活超聲波設備公司;HZ300L恒溫水浴鍋 武漢瑞華儀器設備公司;HPLC,Agilent 1100,Agilent;CX21FS1雙目生物顯微鏡 日本奧利巴斯;MICR017冷凍離心機 美國賽默飛世爾公司;Bx51倒置熒光顯微鏡 奧林巴斯。

1.2實驗方法

1.2.1 藻種的誘變 紫外誘變:取對數生長期的藻液6 mL(細胞密度約為7.8×106個/mL)置于9 cm培養皿底部鋪一薄層,在距離紫外燈光源40 cm距離下,用20 W的紫外燈照射21 min。誘變結束后,避光培養12 h后正常培養3 d。將藻液用新鮮培養基稀釋至10000個/mL藻細胞后涂布于培養基上,置于人工氣候箱中培養。

EMS誘變:取10 mL對數生長期的藻液,4000 r/min下離心10 min,收集藻細胞,加入0.6%的EMS溶液,懸浮至10 mL。30 min后加入1 mL 5%硫代硫酸鈉溶液終止誘變,離心去除誘變液,去離子水沖洗一次之后用新鮮培養液洗滌兩次,置于暗環境中培養12 h后用新鮮的培養基稀釋至10000個/mL藻細胞后涂布于培養基上,置于人工氣候箱中培養。

1.2.2 篩選方法 初篩:用正己烷將尼羅紅粉末配制成0.5 mg/mL的尼羅紅染色液,再用20%DMSO將尼羅紅母液稀釋為0.5 μg/mL,過濾除菌。待平板上長出均勻的微藻藻落時,用1 μg/L的尼羅紅噴染,暗培養24 h后在熒光顯微鏡下觀察藻類染色情況,挑取熒光強度大的單藻落接種到含有2 mL F/2培養基的玻璃試管中,擴大培養。

復篩:將初步篩選結果中的產脂較好的微藻按照10%的接種量擴大培養于含250 mL的培養基的500 mL三角錐形瓶中培養,待到指數生長末期采用8000 r/min,10 min離心收集微藻,-20 ℃預冷凍8 h,冷凍干燥10 h,采用Blight和Dyer[2]方法提取總脂肪酸。

1.2.3 原生質體的制備 取對數生長期的日本小球藻8000 r/min離心10 min,用滅過菌的去離子水洗2～4次,以保證細胞表面無鹽離子和其他雜質影響原生質體的制備。用無菌PBS懸浮細胞并將藻細胞調整至2×107cells/mL。加入終濃度為2%的半纖維素酶,2%纖維素酶與2%果膠酶,對日本小球藻作用時間為8 h,離心后備用。

1.2.4 原生質體再生與融合 原生質體再生與融合以及再生率的計算參考文獻[6]。

1.2.5 基因組改組 以突變株作為基因組改組的第一輪藻株,制備原生質體并進行原生質體融合。融合后的藻液進行稀釋后涂布于再生培養基平板上,待長出藻落后進行初篩和復篩,所得油脂含量提高的藻株作為下一輪基因組改組的親本。

1.2.6 遺傳穩定性檢測 將篩選得到的改組藻株中連續轉接6代,比較第一代與第六代的總脂含量,觀察是否能夠穩定遺傳。

1.2.7 油脂產量以及生物量的測定 將初步篩選結果中的產脂較好的微藻按照10%的接種量擴大培養于含250 mL的培養基的500 mL三角錐形瓶中培養,測定其OD680 nm值。其比生長速率按照以下公式[7]進行計算:

μ=ln(Nt/No)/(Tt-To)

式中，Nt：為穩定期懸浮藻液OD值,No：為接種第2 d懸浮藻液OD值,Tt：為進入穩定期時間,To：為接種第2 d的時間,倍增時間:Dt=0.6931/μ。

對擬微綠球藻和日本小球藻篩選出來的高產GS藻株和原始藻株進行培養,在指數末期收集藻粉用冷凍裝置干燥。將脂肪酸進行甲酯化處理,氣相色譜條件為參考[8]稍作改進:載氣為體積分數為高純度氮氣;柱初溫72 ℃,保溫1 min,以30 ℃/min升溫速率升至150 ℃,保持5 min,以10 ℃/min升溫速率升至250 ℃,保溫5 min;進樣口溫度280 ℃,流速為30 mL/min,進樣量1 μL。

2 結果與分析

2.1候選藻庫的構建

尼羅紅作為一種親脂類熒光染料,與脂類物質結合后在熒光照射后能發出紅色或者橙色熒光。通過測定尼羅紅染色后的熒光強度能判斷其細胞中的油脂含量。將藻液進行尼羅紅染色,觀察細胞中的熒光強度及油脂數量、大小,從而篩選出優勢藻株。

如圖1所示,根據分析結果,經過紫外誘變和EMS誘變共篩選出9株正向突變的誘變藻株,經過遺傳穩定性分析,UC38、EC09、EC24和EC74這4株日本小球藻突變株第一代與第六代的總脂變化含量不顯著(p>0.05),相較于出發藻株,分別提高了29.32%、26.16%、53.67%、34.01%。遺傳穩定性良好。因此選擇UC38、EC09、EC24和EC74這4株藻株作為日本小球藻基因組改組的出發藻株。

圖1 日本小球藻高產誘變株遺傳穩定性考察Fig.1 Genetic stability of the high-liquid mutants of Chlorella hirataii

2.2融合子篩選及遺傳穩定性分析

以候選藻庫中的4株藻株為出發藻株,進行第一輪改組。得到油脂含量進一步提高的藻株:F1C1、F1C2、F1C3、F1C4、F1C5。五株融合株的總脂含量分別為53.02%、49.34%、51.33%、45.72%、50.00%。經遺傳穩定性檢測,日本小球藻第一輪融合藻株F1C2、F1C4和F1C5的遺傳穩定性良好,而F1C1和F1C5可能是異核子,在多次傳代過后會分離成親本類型,其優良性狀也會消失(圖2)。

圖2 日本小球藻第一輪改組篩選結果Fig.2 Genetic stability of the first shuffled strains with high total liquids

以第一輪改組獲得的3株菌株為出發藻株進行第二輪基因組改組,結果獲得6株總脂產量有所提高藻株F2C1、F2C2、F2C3、F2C4、F2C5和F2C6。

將日本小球藻的第二輪改組之后的藻株進行連續傳代培養,在指數生長期末期離心提取總脂肪含量,檢測其遺傳穩定性。

由圖3可知,日本小球藻第二輪融合藻株F2C2的遺傳穩定性良好,第一代與第六代的油脂含量無明顯差異(p>0.05)，其油脂最終含量達到59.01%，較原始菌株提高了101.4%;其他5株藻株性狀表現不夠穩定,第一代與第六代的油脂含量差異顯著(p<0.05),多次傳代后,其優良性狀逐漸喪失。

圖3 日本小球藻第二輪高產優質藻株遺傳穩定性分析Fig.3 Genetic stability of the second shuffled strains with high total liquids

2.3改組藻株和原始藻株的生長特性以及生物量

由圖4可以看出,日本小球藻的改組藻株與出發藻株的生長曲線基本相似。從這幾株微藻的生長曲線可以看出,日本小球藻在接種后沒有適應期。F2C2的生長速率和出發藻株相差不大。在1～6 d出發藻株的生長速率要大于改組藻株F2C2,在這之后F2C2的生長速率就快于出發藻株。

圖4 日本小球藻改組和原始藻株的生長曲線測定Fig.4 The Chlorella hirataii’s growth curve of GS strains

由圖5和圖6結果可以看出,全面地評價微藻藻株的產油潛力,不僅需要看總脂含量或生物量干重來判斷,同時需要引入單位體積總脂含量和單位體積總脂產率2個指標,通過綜合比較、分析,篩選出優良的高產油微藻藻株。以藻液單位體積總脂含量和總脂產率為評價指標,根據SPSS的分析結果得知,與出發藻株相比，改組藻株的單位體積總脂含量和單位體積總脂產率都有了顯著的提高(p<0.05)。

圖5 日本小球藻出發藻株與F2C2單位體積總脂產率Fig.5 The total fat yield per unit volume of the orginal Chlorella hirataii and F2C2

圖6 日本小球藻出發藻株和F2C2單位體積總脂含量Fig.6 Total fat content per unit volume of the orginal Chlorella hirataii and F2C2

2.4日本小球藻總脂含量的組分分析

由圖7可知，改組前后的日本小球藻氣相色譜圖的峰形以及出峰時間沒有變化,說明改組前后的日本小球藻的總脂組成成分沒有變化。由于兩個氣相圖譜的峰值大小有差異,說明改組藻株和初始藻株的總脂肪酸的組分含量有很大變化。

圖7 日本小球藻初始藻株(a) 與改組藻株F2C2(b)的氣相圖譜Fig.7 Gas chromatogram of the original Chlorella hirataii and F2C2

3 討論與結論

雖然經典的隨機誘變、定向篩選的育種方法工作量大,周期長,隨機性強,效率低,很難在短時間內獲得高產量的正向突變株,但是依然是目前使用的主要育種手段。genome shuffling是在整個微生物基因組水平上進行重排的技術,經過遞歸式多次融合,使基因組在較大范圍內發生交換和重組,將引起正向突變的不同基因重組到一個細胞中。目前國內外通過genome shuffling獲得高產油脂的藻株的選育還鮮有報道。利用基因組技術成功選育脂肪酶[9]、谷氨酸[10]和抗生素[11]高產菌株的報道證明,基因組改組技術是一種行之有效的育種方法。

進行基因組改組首先需要構建一個候選菌庫,該菌庫中各正突變株的基因組之間差別越大,基因組改組后獲得表型有較大改進的雜交菌種的可能性就越大[12]。本研究在紫外誘變和甲基磺酸乙酯誘變獲得幾種不同的正向突變株的基礎上,采用基因組改組技術將各正向突變體親本進行雜交融合,篩選整合各正向突變的重組子代。改進篩選方法,采用尼羅紅熒光染色法對微藻進行初步產油鑒定,尼羅紅染色法可以直觀觀察細胞內的油脂含量情況,相比氣相色譜操作更方便,操作時間更短,僅需簡單染色即可,因此選擇尼羅紅染色法進行初篩更高效。

日本小球藻的種內融合會造成細胞大小產生變化,但是由于遺傳物質以及代謝產物等內容物基本一致,其細胞生理生化特性也不會發生很大變化。兩個原生質體的融合產生的也不一定是融合子,也有可能是異核體。異核體并非真正的融合子,結構并不穩定。隨著細胞分裂的發生,新的性狀也會漸漸消失變成親本特性[13]。所以為了得到性狀穩定遺傳的融合子,需要對篩選出來的藻株進行連續傳代來培養考察其優良的遺傳穩定性。本文中所得到的融合藻株的遺傳穩定性均不高,可能在于微藻的細胞結構相較于原核生物更為復雜,細胞融合較為困難。

經過多輪融合篩選過后選育出了日本小球藻高產油脂藻株F2C2,其油脂最終含量達到59.01%,較原始藻株提高了101.4%。在實現規模化微藻生產之前,還需要進行大量的科研工作,如優化藻株的生長條件,對微藻進行基因水平的定向分子改造。

[1]Posten C,Schaub G. Microalgae and terrestrial biomass as source for fuels-a process view[J]. Journal of Biotechnology,2009,142(1):64-69.

[2]Harun R,Danquah M K,Forde G M. Microalgal biomass as a fermentation feedstock for bioethanol production[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology,2010,85(2):199-203.

[3]Shi D J,Wang C L,Wang K M. Genome shuffling to improve thermotolerance,ethanol tolerance and ethanol productivity ofSaccharomycescerevisiae[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2009,36(1):139-147.

[4]Lee B U,Choi M S,Kim D M,et al. Genome Shuffling ofStenotrophomonasmaltophilia,OK-5 for Improving the Degradation of Explosive RDX(Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine)[J]. Current Microbiology,2017,74(2):268-276.

[5]Dai M,Copley S D. Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide pentachlorophenol bySphingobiumchlorophenolicumATCC 39723[J]. Applied and Environmental Microbiology,2004,70(4):2391-2397.

[6]P Greenspan,EP Mayer,SD Fowler. Nile red:a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets[J]. Journal of Cell Biology,1985,100(100):965-73.

[7]陳波. 兩種微型綠藻營養生理及原生質體制備與雜交育種的研究[D]. 廣州：暨南大學,2000.

[8]Liang Y,Beardall J,Heraud P. Effects of nitrogen source and UV radiation on the growth,chlorophyll fluorescence and fatty acid composition of Phaeodactylum tricornutum,and Chaetoceros muelleri,(Bacillariophyceae)[J]. Journal of Photochemistry & Photobiology B Biology,2006,82(3):161-72.

[9]Wang H K,Jie Z,Wang X J,et al. Genome shuffling improves production of the low-temperature alkalophilic lipase by Acinetobacter johnsonii[J]. Biotechnology Letters,2012,34(1):145-151.

[10]張媛媛,李家洲.基因組改組快速提高谷氨酸棒桿菌L-鳥氨酸產量[J].食品科學,2012,33(15):206-209.

[11]金慶超,沈娜,楊郁,等. spy1的DNA改組提高普那霉素的產量[J].中國抗生素雜志,2015,40(3):178-182.

[12]張克旭,陳寧.用原生質體融合技術選育谷氨酸高產菌[J].微生物學報,1991(2):108-114.

[13]王幼平,張莉莉,吳曉霞.原生質體融合[J].生物學通報,2009,44(8):7-9.

IncreasethelipidproductionofChlorellahirataiirapidlybygenomeshuffling

LIUHong-quan,YUANSha,LUEn-qiu,PANYi-hua,YANGHai-yan,LONGHan,XUANJin-cai,HEXiu-miao

(College of Ocean and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities,Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification，Nanning 530007,China)

StrainChlorellahirataiiwas used as the starting strains for genome shuffling. They were mutated by UV-light and ethylmesylate separately,and four mutant strains with increased lipids yield were selected. Two rounds of genome shuffling were carried out with the four mutant strains using PEG to mediate protoplasts fusion. Finally,theChlorellahirataiiF2C2 was selected which produced lipids(59.01%)higher than the original strain by 101.4%. Compare with the original strain in the same batch,the total lipid composition of theChlorellahirataiiF2C2 didn’t change a lot,but there was a big gap between the content of each component.

genome shuffling;total lipid content;Chlorellahirataii

2017-04-11

劉紅全(1975-)，男，博士，副教授，主要從事植物分子生物學方面的研究，E-mail:lhongquan@163.com。

國家自然科學基金(30960215)；廣西自然科學基金(桂科青0728019)；廣西民族大學相思湖青年學者創新團隊資助項目。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0096-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.020