索氏法提取和測定油茶籽油的條件優化

,,,明懷

(1.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室,廣東廣州 510520; 2.廣東省林業科學研究院,廣東廣州 510520)

索氏法提取和測定油茶籽油的條件優化

王靜1,2,張盟雨1,2,張應中1,2,王明懷1,2

(1.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室,廣東廣州 510520; 2.廣東省林業科學研究院,廣東廣州 510520)

除富含不飽和脂肪酸的茶油外,油茶中還含有茶多糖、茶皂素、茶多酚等多種生物活性成分。以油茶生物活性物質的提取和制備為前提,本研究以簡單、有效地提取茶油為目標,以油茶籽含油率為指標,在索氏抽提法單因素實驗基礎上,選擇提取時間、提取溫度、提取溶劑種類和單次樣品重量為影響因素進行正交優化實驗。結果表明,油茶索氏提取的最佳條件為:提取時間6 h、提取溫度80 ℃、有機溶劑丙酮、單次樣品重量4 g。該條件下茶籽含油率達43.24%±0.53%。該條件下測得4種油茶整籽和種仁的含油率從高到低依次為廣寧紅花油茶、普通油茶、小果油茶和高州油茶;廣寧紅花油茶的整籽和種仁含油率均最高,且餅粕含油率最低,分別為49.7%、67.5%和6.1%。優化后的油茶索氏抽提條件,適用于茶油成分的有效提取和針對油茶籽油的定量分析。

索氏抽提法,油茶籽油,提取,測定

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科山茶屬,常綠小喬木或灌木,是中國南方重要的經濟林木,也是我國特有的多年生木本油料作物[1-2]。油茶籽可榨油供食用,茶油營養成分豐富,脂肪酸結構合理,富含油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸,且不飽和脂肪酸含量達90%以上[3],其相對質量分數高于橄欖油[4-5]。是一種健康型高級食用油[6],還被廣泛應用到醫藥、化妝品、工業制造等其他領域[4,7-11]。此外,油茶中含有大量的生物活性成分,如油茶多糖[2,12]、茶多酚[13-14]、茶皂素[15]、茶多肽[16]等。且在橄欖中不存在的茶多酚和茶皂素,分別具有降低膽固醇和溶血栓等功能[17],因此油茶活性物質具有極大的研究價值。

油茶活性物質的研究首先需在保留其生物活性的前提下,進行提取和測定,因此油茶活性物質提取過程中研究茶油的有效提取和準確測定具有必要性。目前,茶油的提取方法主要有有機溶劑浸出法、水代法、水酶法、超臨界CO2萃取法、壓榨法等[18],油茶含油率測定方法有索氏抽提法[19]、折光指數測定法[20]、近紅外光譜法[21]、核磁共振檢測技術[22]等,索氏抽提法能夠滿足油脂的提取[23-25]和含油率的測定[3,20]。本研究以簡單、經濟、有效地提取茶油組分為目標,在傳統的索氏抽提測定植物油脂基礎上進行條件優化,并測定4種油茶含油率,為油茶活性物質的提取與制備提供前期基礎。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

普通油茶、廣寧紅花油茶、小果油茶、高州油茶 分別由廣東省韶關市曲江區小坑國營林場、廣寧康帝公司、廣東省興寧市林業科學研究所、廣東省高州市林業科學研究所提供,均為2015年11月～12月采收成熟的油茶籽,部分壓榨成餅粕;無水乙醇 廣州化學試劑廠;石油醚(沸點60～90 ℃) 天津化學試劑廠;丙酮、無水乙醚、乙酸乙酯、正己烷 天津市大茂化學試劑廠。

AR423CN千分之一電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;SXT-06索氏抽提器三臺和HWS-26數顯恒溫水浴鍋 上海洪紀儀器設備有限公司;DHG-9240X電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;AWL-1001-U超純水系統 美國艾科浦國際有限公司;SB-5200DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;超速離心機 德國Eppendorf公司。

1.2原料預處理

利用高速粉碎機將油茶整籽、種仁和餅粕粉碎成小顆粒后,用60目篩去除大顆粒。過篩后經75 ℃烘干至恒重,分裝于密封袋中,室溫保存、干燥備用。

1.3實驗方法

1.3.1 單因素實驗設計 普通油茶籽為原料,采用索氏抽提法,分別對提取時間(2、4、6、8、10、12 h)、提取溫度(60、65、70、75、80、85 ℃)、有機溶劑種類(無水乙醇、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醚)、單次樣品重量(1、2、4、6、8、10 g)四個因素分別進行單因素實驗,重復3次取平均值,考察各個因素對普通油茶籽含油率的影響,測定提取前、后普通油茶籽質量并計算其含油率。

1.3.2 正交優化實驗設計 單因素實驗表明,索氏抽提法提取茶油組分時,提取時間、提取溫度、有機溶劑種類和單次樣品重量對含油率均有不同程度的影響。普通油茶籽為原料,根據單因素實驗結果和正交實驗原理為基礎進行4因素4水平實驗L16(44)(每組三平行),以確定索氏抽提對普通油茶籽含油率的最佳條件。實驗設計因素與水平見表1。

表1 正交實驗設計因素與水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiments

1.3.3 驗證實驗 分別通過二次提取和無水乙醚提取對比實驗,以驗證正交優化實驗的最佳提取條件的科學性。

1.3.3.1 二次提取 采用正交實驗的最佳優化條件,進行連續兩次索氏提取,計算第二次含油率,對正交優化實驗結果進行驗證。

1.3.3.2 無水乙醚提取 索氏法提取許多植物油脂的最佳有機溶劑為無水乙醚[26-29],本研究以普通油茶籽為原料,最佳提取條件下的索氏抽提含油率,與以無水乙醚為有機溶劑的索氏抽提含油率進行比較,以驗證正交優化實驗結果。

1.3.4 油茶含油率測定 在優化后的索氏抽提條件下,分別對普通油茶、廣寧紅花油茶、小果油茶和高州油茶的整籽、種仁和餅粕含油率進行測定和對比。

1.3.5 計算方法 采用稱量法測定樣品質量,以計算油茶含油率。

式中，G1:索氏抽提前的樣品質量,g;G0:索氏抽提后的樣品質量,g。

1.4數據處理

采用Excel 2010和GraphPad Prism 7軟件對實驗數據進行差異分析和作圖。

2 結果與分析

2.1索氏抽提法的單因素實驗

2.1.1 提取時間對索氏法提取和測定茶油的影響 在抽提溫度75 ℃、有機溶劑石油醚、單次樣品重量10 g的條件下,以普通油茶籽為原料,對提取時間(2、4、6、8、10、12 h)進行單因素分析。由圖1可知,隨著提取時間(2～12 h)的延長,傳質逐漸達到平衡,含油率提高,提取時間為6 h時含油率趨于穩定;隨后增加提取時間,含油率增長緩慢。其原因可能是隨著提取時間的延長,油茶籽中的油脂逐漸被有機溶劑溶解析出,在6 h以后茶油幾乎被完全提取。通過單因素方差分析得知,在6 h后差異不顯著(p>0.05),因此選擇提取時間為6～12 h作為正交優化實驗的因素值。

圖1 提取時間對含油率的影響Fig.1 Effect of extraction time on oil content

2.1.2 提取溫度對索氏法提取和測定茶油的影響 在抽提時間8 h、有機溶劑石油醚、單次樣品重量10 g的條件下,以普通油茶籽為原料,考察溫度(60、65、70、75、80、85 ℃)對索氏法提取茶油的影響,結果如圖3所示。在溫度60～85 ℃時,含油率隨提取溫度的升高而提高,含油率在80 ℃時達到平衡點;當溫度繼續升高時,含油率沒有顯著變化(p>0.05)。這可能是因為溫度的升高加快了分子間的熱運動,進而加快溶質的擴散和溶劑的滲透[30-31],提高了茶油在石油醚中的溶出速度;但當油脂分子熱運動加劇到一定程度,提取溫度的升高則很難繼續提高含油率[32-33]。考慮到油茶生物活性物質的變性溫度,因此將提取溫度設定在65～80 ℃范圍作為正交優化實驗的因素值。

圖2 提取溫度對含油率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on oil content

2.1.3 有機溶劑種類對索氏法提取和測定茶油的影響 在抽提時間8 h、提取溫度75 ℃、單次樣品重量10 g的條件下,以普通油茶籽為原料,分別選取無水乙醇、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮和無水乙醚作為有機溶劑進行單因素實驗。由圖3可知,不同有機溶劑對油茶籽油的溶解性不相同,丙酮和無水乙醚分別為有機溶劑時,普通油茶籽的含油率最高,其次分別是石油醚、乙酸乙酯和正己烷,最后無水乙醇為溶劑的含油率最低。無水乙醚極易揮發且低濃度可致人昏迷,不適合作為實驗試劑長期使用[3],因此選擇石油醚、乙酸乙酯、丙酮和正己烷四個水平作為正交優化實驗的因素值,這與楊柳[3]的實驗結果基本一致。

圖3 有機溶劑種類對含油率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent kinds on oil content

2.1.4 單次樣品重量對索氏法提取和測定茶油的影響 在抽提時間8 h、提取溫度75 ℃、有機溶劑石油醚的條件下,以普通油茶籽為原料,分別以1、2、4、6、8、10 g的單次樣品重量為影響因素進行3平行實驗,結果如圖4所示。隨著單次樣品重量(1～10 g)的增加,含油率先稍有增加后迅速下降;單次樣品重量為4 g時,含油率最高。其原因可能是抽提瓶內空間有限,單次樣品重量影響抽提瓶內油茶籽與有機溶劑的傳質速率,進而影響茶油在溶劑中的溶解效率。單次油茶籽重量較低,石油醚對茶油的提取率降低;單次油茶籽重量過高,抽提瓶內油茶籽與石油醚接觸面積受限,茶油在特定時間內不能完全溶解進石油醚,因此計算后的含油率結果降低。通過單因素方差分析得知,在單次樣品重量≤2 g時含油率差異不顯著(p>0.05),因此選擇單次樣品重量為2～8 g作為正交優化實驗的因素值。

圖4 單次樣品重量對含油率的影響Fig.4 Effect of weight of single sample on oil content

2.2索氏抽提法的正交優化實驗

根據單因素實驗結果,不考慮因素之間的交互作用,選取提取時間、提取溫度、有機溶劑種類和單次樣品重量4個因素,各取4個水平(表2),進行正交實驗設計,結果和分析見表2和表3。

表2 正交實驗設計與結果Table 2 Experiment design and corresponding results of orthogonal design

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

注：F0.05(3,4)=9.12;*,差異顯著p<0.05。

極差大小可用來衡量實驗中各因素作用的大小,極差值越大,說明顯著性越高,反之說明顯著性越低[34]。由表2可知,4個因素對索氏法提取和測定茶油的影響順序為C>B>A>D,即依次為有機溶劑種類、提取溫度、提取時間、單次樣品重量。空列極差反應因素之間的交互作用,當某因素極差大于空列極差,表明該因素的效應存在[34],空列極差是判斷實驗各因素效應是否可靠的界線。因素有機溶劑種類和提取溫度的極差(分別為26.34和11.42)均大于空列極差(11.38),說明有機溶劑種類和提取溫度是影響索氏法提取和測定茶油的主要因素,且有機溶劑種類對實驗的影響明顯比時間因素大。最優組合為A1B4C3D2,即有機溶劑丙酮、提取溫度80 ℃、提取時間6 h、單次樣品重量4 g。

由表3可知,有機溶劑種類對索氏法提取和測定油茶籽油結果有顯著性影響(p<0.05),提取時間、提取溫度和單次樣品重量對含油率結果無顯著性影響。在此條件下,進行重復實驗,得到的普通油茶籽含油率達43.24%±0.53%。

2.3驗證實驗

為了進一步驗證正交優化實驗結果的可靠性,分別進行二次提取和無水乙醚提取比較實驗。首先,在最佳優化條件下,分別對普通油茶籽、廣寧紅花油茶籽、小果油茶籽和高州油茶籽進行連續兩次提取,索氏法測定油茶籽第二次含油率均低于4.10%,僅為第一次含油率的0%～9.5%。因此,方法優化后的提取條件對油茶籽油的提取率達90.5%以上。與《GB/T 14488-2008 植物油料 含油量測定》的三次抽提(4 h+2 h+2 h)相比,不僅縮短了抽提時間(總6 h),也減少了索氏抽提次數,降低了工藝成本和時間。其次,普通油茶籽為原料,無水乙醚為有機溶劑的含油率為37.21%±0.15%,最佳優化條件下的含油率為43.24%±0.53%。因此優化后的條件達到了快速、簡單、有效提取茶油組分的目的。

2.4四種油茶含油率的測定

利用正交實驗的最佳提取油茶籽油的條件,分別測定和比較普通油茶、廣寧紅花油茶、小果油茶和高州油茶整籽、種仁和餅粕的含油率,結果見表4。

由表4可知,4種油茶整籽和種仁中,廣寧紅花油茶的含油率最高,分別為49.74%±0.68%和67.54%±0.33%;其次為普通油茶,其整籽和種仁的含油率分別為43.24%±0.53%和55.29%±0.17%;第三為小果油茶,其整籽和種仁含油率分別為32.04%±1.12%和51.91%±0.38%;高州油茶整籽和種仁的含油率最低,分別為19.88%±0.42%和44.42%±1.95%。餅粕是茶油生產過程中的副產物,其含油率從低到高分別為廣寧紅花油茶(6.13%±0.26%)、小果油茶(6.67%±0.19%)、高州油茶(11.10%±0.58%)和普通油茶(12.32%±0.36%)。

表4 四種油茶整籽、種仁和餅粕含油率的測定Table 4 Determination of four kinds of Camellia oleifera whole seeds,seed kernels and seed cakes

3 結論

在單因素實驗的基礎上通過正交實驗，確定索氏法提取和測定茶油的最佳條件為:提取時間6 h、提取溫度80 ℃、有機溶劑種類丙酮、單次樣品重量4 g。驗證實驗表明,該條件下油茶籽油的提取率達90.5%以上,實現了簡單、有效地提取茶油成分的目的。茶油組分的高效提取將有利于油茶活性物質提取和制備工藝的深入研究。

在優化后的提取條件下分別測定普通油茶、廣寧紅花油茶、小果油茶和高州油茶的含油率。整籽和種仁的含油率從高到低分別為廣寧紅花油茶、普通油茶、小果油茶和高州油茶。本研究根據國標《GB/T 14488-2008植物油料 含油量測定》以及以往研究對植物油脂的測定條件進行了摸索優化,建立了較優的油茶籽和餅粕含油率的測定條件,適用于對油茶籽油的定量分析。

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OptimizationofsoxhletextractionmethodforextractionanddeterminationofCamelliaoleiferaseedoil

WANGJing1,2，ZHANGMeng-yu1,2，ZHANGYing-zhong1,2，WANGMing-huai1,2

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture,Protection and Utilization,Guangzhou 510520,China; 2.Guangdong Academy of Forestry,Guangzhou 510520,China)

In addition to high concentrations of unsaturated fatty acids inCamelliaoil,Camelliaoleiferaalso contains polysaccharides,saponins,polyphenols and other bioactive ingredients. On the premise of the extraction and preparation of bioactive substance fromC.oleifera,with simple and effective extraction of oil as the goal in this study,oil content as index,the orthogonal design was carried out to investigate the effect of extraction time,extraction temperature,extraction solvent kinds and weight of single sample after single factor test with soxhlet extraction method. The results showed that the optimum conditions of soxhlet extraction were as follows:extraction time 6 h,temperature 80 ℃,organic solvent acetone,single sample weight 4 g. Under this condition,the content ofC.oleiferaseed oil was more than 43.24%±0.53%. The oil contents of both whole seeds and seed kernels from high to low were followed byC.semiserrataChi,C.oleiferaAbel,C.meiocarpaHu andC.gauchowensisChang. The highest oil contents of both whole seeds and seed kernels were fromC.semiserrataChi,while oil content of seed cakes was the lowest,which were 49.7%,67.5% and 6.1%,respectively. The optimized soxhlet extraction conditions were applicable for the effective extraction and the quantitative analysis ofC.oleiferaseed oil.

soxhlet extraction;Camelliaoleiferaoil;extraction;determination

2017-03-03

王靜(1986-)，女，博士，主要從事植物活性物質方面的研究，E-mail：wangjingmos@hotmail.com。

廣東省林業科技創新項目(2017KJCX003)；廣東省省級科技計劃重點項目(2015B020202002)；廣東省省級科技計劃項目(2014A020208043)。

TS224

A

1002-0306(2017)21-0042-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.009