番木瓜葉不同溶劑提取物的 抗氧化性能

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(中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，農業部熱帶果樹生物學重點實驗室,廣東湛江 524091)

番木瓜葉不同溶劑提取物的 抗氧化性能

劉玉革,付瓊,馬飛躍,張秀梅*

(中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，農業部熱帶果樹生物學重點實驗室,廣東湛江 524091)

以番木瓜葉為研究對象,用水、70%甲醇和70%乙醇對其中活性物質進行了提取。測定了三種試劑提取率、總酚以及總黃酮含量,還對提取物的自由基清除能力、金屬離子螯合能力(MCC)和鐵離子氧化還原能力(FRAP)進行了研究。結果表明提取得率和總酚含量的大小順序是:水>70%甲醇>70%乙醇,而總黃酮的含量與此相反。三種提取物都具有良好的DPPH·、ABTS+·和·OH自由基清除能力、金屬離子螯合能力(MCC)和鐵離子氧化/還原能力(FRAP)。綜合考慮提取率、活性物質含量和各種抗氧化指標,70%甲醇被選為最合適的番木瓜葉提取試劑。該研究為番木瓜葉在制備天然抗氧化劑方面的應用提供了實驗基礎,還提高了番木瓜的整體利用價值。

番木瓜葉,溶劑,提取物,抗氧化性能

番木瓜(CaricapapayaL.)屬于番木瓜科(Caricaceae),是一種多年生植物,其原產地為墨西哥和中美洲,后來廣泛種植于斯里蘭卡、菲律賓、印度、東赤道非洲、南美洲等熱帶和亞熱帶地區。番木瓜(以下簡稱木瓜)17 世紀傳入我國,主要種植在廣東、海南、臺灣、廣西、福建、云南等省份。

木瓜成熟的果肉有黃色和紅色兩種,黃色果肉主要含胡蘿卜素,紅色果肉主要含番茄紅素,除此之外還含豐富的糖分、蛋白質、脂肪、有機酸、維生素A、B1、B2、C及可溶性鈣、鐵等營養成分[1-4]。除食用外,木瓜在藥用方面也有廣泛的用途。番木瓜的提取物具有抗氧化、抗原生蟲、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、降壓、降糖、降血脂藥、抗腫瘤、自由基清除、抗鐮形細胞、神經保護、利尿等多種生物活性[5-10]。

除果肉外,木瓜的其他部位在不同地區傳統醫藥中也被廣泛應用,如葉、皮、根等。木瓜葉之前都被當作廢棄物處理掉,最近越來越多的研究表明，其在藥物、抗氧化等方面具有巨大的應用前景。Vuong 等人優化了用水提取木瓜葉多酚的條件,研究結果發現木瓜葉提取物具有良好的自由基清除能力和總還原能力[11]。此外,還有報道表明木瓜葉提取物具有較好的抗菌活性和抗癌作用[12-14]。

然而,對于不同試劑提取出的木瓜葉提取物的抗氧化性能還沒有報道。盡管Vuong等人在他們的研究中初步比較了水和其他幾種提取試劑對木瓜葉中多酚提取的影響,但是他們的提取條件并不相同,此外他們也沒有比較不同提取物的抗氧化性能[11]。

本研究在相同條件下使用不同溶劑對木瓜葉進行了提取,測定了其中的總酚含量并研究了自由基清除能力、鐵離子氧化/還原能力(FRAP)等抗氧化能力。在綜合考慮抗氧化能力的基礎上給出了木瓜葉的最佳提取溶劑。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

木瓜葉片 采自中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所種植資源圃，選取無病蟲害的成熟葉片,清洗干凈后自然曬干,用粉碎機粉碎后過40目篩；1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、菲咯嗪(Ferrozine)、TPTZ、沒食子酸、蘆丁 Sigma公司;Folin-Ciocalteu(福林酚)試劑 Sigma-Aldrich公司;ABTS Biosharp公司;其他試劑 均為分析純。

UV-2700紫外分光光度計 日本島津公司;Hei-VAP Precision ML旋轉蒸發儀 德國Heidolph;FD-IC-50冷凍干燥機 上海喬躍電子有限公司。

1.2木瓜葉抗氧化物質的提取

選取蒸餾水、70%的甲醇和70%的乙醇溶液為提取試劑。準確稱取1.0 g處理好的木瓜葉干粉放入100 mL單頸瓶中,分別加入不同試劑30 mL于70 ℃攪拌回流2 h。冷卻后離心分離(8000 r/min,10 min),固體殘渣用同樣方式再提取2次,合并提取液并在40 ℃減壓濃縮得固體干粉。每個測試設三次重復。

1.3總酚、總黃酮及抗氧化性能測試

將不同試劑提取得到的三種干粉物質用甲醇溶解為0.4 mg/mL的溶液,之后的測定都用溶液來完成。

1.3.1 總酚、總黃酮的測定 總酚按照文獻[15]中的方法進行測定。準確移取0.5 mL木瓜葉提取液,加入1 mL福林酚試劑(預先用水稀釋到原始濃度十分之一)和0.8 mL水。室溫靜止5 min后加入1.0 mL碳酸鈉溶液(7.5%),于黑暗中反應30 min后在765 nm測定吸光度。用100 mg/L的沒食子酸儲備液配置濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L的標準液用于制作標準曲線。結果以每克干質量達到同樣吸光度所需的沒食子酸質量(mg GAE/g干重)表示。

總黃酮按照Kim等人報道的方法進行測定[16]。準確移取3 mL木瓜葉提取液(0.4 mg/mL)加入2 mL水和5%亞硝酸鈉0.5 mL,靜置6 min后加入10%硝酸鋁0.5 mL。之后加入4%氫氧化鈉4.0 mL并室溫靜置15 min后在510 nm測定吸光度。用200 mg/L的蘆丁儲備液配制濃度為4、8、12、16和20 mg/L的標準液用于制作標準曲線，標準曲線方程為C(濃度)=0.0643+0.8123A(吸光度)(R2=0.998)。結果以每克干質量達到同樣吸光度所需的蘆丁質量(mg RTE/g 干重)表示。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定 體外清除自由基的能力通過測量提取液加入前后DPPH在525 nm的吸光值來測定[17]。稱取一定量的DPPH,用甲醇配成0.2 mmol/L的溶液放入冰箱備用。測定時準確吸取0.4 mg/mL的各種樣液1.0 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液2 mL,搖勻,37 ℃水浴30 min。于波長525 nm處測定各管吸光度(A1)。以相同體積的水代替樣液,測定其吸光度作為空白對照(Ao)。

DPPH清除率(%)=(Ao-A1)/Ao×100

1.3.3 ABTS自由基清除能力測定 將ABTS+·配制成7 mmol/L的溶液,測定前與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液混合,暗處放置12 h以上,用時需用甲醇稀釋溶液使其在732 nm的吸光度為0.7～0.8[18]。測定時準確吸取0.4 mg/mL的樣液0.5 mL,加入ABTS+·反應液4 mL,避光反應6 min。于波長732 nm處測定各管吸光度(As)。用0.5 mL水代替樣液加入ABTS+反應液作為對照(Ac)。

ABTS+清除率(%)=(1-As/Ac)×100

1.3.4 羥自由基(·OH)清除能力測定 根據文獻報道方法進行羥自由基清除能力測定[19]。取0.4 mg/mL的不同樣液2.0 mL,加入 6 mmol/L FeSO4·7H2O溶液2 mL和6 mmol/L H2O2溶液2 mL,搖勻,靜置10 min后再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL,搖勻并在37 ℃水浴中反應30 min,于波長510 nm處測定各管吸光度A樣品。用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度為A對照。用蒸餾水代替木瓜葉多酚提取液按上述方法測定吸光度為A空白。以下式計算·OH清除率。

1.3.5 金屬離子螯合能力(MCC)測定 MCC的測定按照Dinis 等報道的方法進行[20]。準確移取0.4 mg/mL的樣液1.0 mL,加入2.8 mL蒸餾水、2 mmol/L FeSO4·7H2O溶液50 μL和2.5 mmol/L菲咯嗪溶液150 μL。反應體系在漩渦振蕩器上振蕩30 s后在25 ℃反應10 min,最后在波長562 nm處測定各管吸光度。以蒸餾水替代樣品作為對照。

MCC(%)=(A對-A樣)/A對×100

1.3.6 鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)的測定 FRAP利用試劑盒進行測定。取10 μL不同試劑提取樣品(0.4 mg/mL)加入到96微孔板中,然后加入200 μL新鮮配制的TPTZ工作液混勻,37 ℃水浴反應30 min后在595 nm測定吸光度,以不同濃度可溶性VE(Trolox,0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L)為標準物做標準曲線，標準曲線方程為C(濃度)=0.0643+0.8123A(吸光度)(R2=0.998)。樣品抗氧化活性(FRAP值)以每克干質量達到同樣吸光度所需的Trolox微摩爾數(μmol/L Trolox/g干重)表示。

1.3.7 數據處理 采用SPASS 17.0統計軟件進行數據分析,Origin Pro 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1總酚含量及不同試劑的得率

三種溶劑對木瓜葉進行提取的提取率和總酚、總黃酮含量見表1。由表1可知，提取得率的順序為水>70%甲醇>70%乙醇,總酚含量的順序同提取率一樣。除乙醇溶液外,水和甲醇作為提取劑的總酚含量都高于Vuong 等人報道的方法,三種試劑的活性物質得率和總黃酮含量也都遠遠高于他們的結果[11]。這說明該研究中使用的方法更有利于木瓜葉中活性成分的提取。

表1 不同溶劑的得率和總酚、總黃酮含量Table 1 The extraction yeild,contents of total phenol and flavonoid of different solvents

注：a:折合為原始干葉重量。

2.2木瓜葉提取物的自由基清除能力

由于操作簡便以及不容易受到多酚副反應干擾,DPPH自由基清除能力是最常使用的用于評估物質抗氧化能力的方法之一。在激發態時DPPH在525 nm有吸收,而在吸收了氫離子或電子后這種吸收會消失,其變化程度與自由基清除程度呈線性關系。清除率越大,表明該物質對自由基的清除能力越強。

不同溶劑提取物的DPPH自由基清除能力見圖1A。由圖1A可知三種試劑提取物的DPPH自由基清除能力基本相同(水、70%甲醇溶液和70%乙醇提取物清除能力分別為87.2%±0.12%、87.9%±0.16%和83.8%±0.81%)。這說明盡管提取溶劑在極性上存在較大差異,但是他們的提取物中能夠清除DPPH自由基的活性物質相差無幾。

不同溶劑提取物對ABTS+的清除能力見圖1B。與DPPH的結果不同,在這三種溶劑中70%乙醇的提取物對ABTS+的清除能力最高,其次為70%甲醇和水的提取物,并且三者之間差異顯著。由表1可知,這個順序與提取物中總黃酮的含量順序一致。這可能是因為在有機溶劑中黃酮類物質的偶極矩較低,因此有利于該類物質的提取,而黃酮類在水中的溶解度較低。因此用甲醇和乙醇溶液提取的黃酮含量明顯高于水提效果[21-22],其對ABTS+的清除能力也同樣有差異,這跟Vuong 等人的結果相同[11]。

羥自由基是活性氧中最活潑的自由基,也是毒性最大的自由基[23],羥自由基消除率是反映物質抗氧能力的重要指標。由圖1C可知三種試劑提取物對羥自由基的清除能力為:70%甲醇>水>70%乙醇。三種提取物對羥自由基都有良好的清除能力。對自由基的清除結果表明三種試劑的提取物都具有良好的自由基清除能力,這說明木瓜葉在制備天然抗氧化劑方面具有潛在用途。

圖1 木瓜葉三種試劑提取物的DPPH·(A)， ABTS+·(B)和·OH(C) 自由基清除能力Fig.1 The radical scavenging abilities of the papaya leaf extracts to DPPH·(A), ABTS+·(B) and ·OH(C)注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；圖2，圖3同。

2.3金屬離子螯合能力(MCC)和鐵離子氧化還原能力(FRAP)

三種試劑提取物的MCC值見圖2。由圖2可知MCC的大小順序為70%乙醇>70%甲醇>水,其中原因可能同因為有機相中黃酮類物質含量較高。

圖2 木瓜葉三種提取物的金屬離子螯合能力Fig.2 MCC of the three extracts of papaye leaf

FRAP的測定原理是根據抗氧化物質將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與TPTZ結合生成藍色絡合物,在波長595 nm處有最大光吸收。吸光度越大,表明抗氧化劑有越強的還原能力,因而具有越高的抗氧化活性。該方法反映的不是物質的某一種自由基清除能力,而是樣品總的還原能力,因此可用來反映樣品總的抗氧化活性[24]。由三種試劑提取后測定的FRAP結果見圖3。從圖3中可以看出，用有機溶液提取的效果明顯好于水溶液。三種試劑提取后的FRAP的大小順序為70%甲醇>70%乙醇>水(數值分別為(1088±18.4)、(947±20)和(818±15.4) μmol/L/g干重,圖3)。這說明由甲醇溶液提取后提取物的抗氧化活性最高,而水的提取物活性最低。

圖3 木瓜葉三種提取物的FRAPFig.3 FRAP of the three extracts of papaye leaf

盡管用水做提取劑時得率最高,但這時提取物中總黃酮的含量并不高于70%甲醇,抗氧化指標也都低于70%甲醇提取物。這可能是因為用水做提取試劑時一些溶于水的小分子,例如單糖等物質更容易被提取,而這些物質抗氧化活性較差。因此,盡管提取率高,水并不是對木瓜葉活性物質提取的最佳試劑。這與Vuong等人的結果不同[11]。

3 結論

用水、70%甲醇和70%乙醇來提取番木瓜葉,所得三種提取物都具有良好的自由基清除能力和抗氧化能力。綜合考慮提取得率、總酚、總黃酮含量和各種抗氧化性能指標,70%甲醇是這三種試劑中最適合的木瓜葉提取試劑。該研究表明番木瓜葉具有較高的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性。這不僅為番木瓜葉在制備天然抗氧化劑方面提供了實驗依據,還可提高番木瓜整棵植株的利用價值。

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Antioxidantactivitiesofpapayaleafextractswithdifferentextractionsolvents

LIUYu-ge,FUQiong,MAFei-yue,ZHANGXiu-mei*

(Key Laboratory of Tropical Fruit Biology of Ministry of Agriculture,the South Subtropical Crop Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science,Zhanjiang 524091,China)

The bioactive compounds of payapa leaf were extracted by water,70% methanol and 70% ethanol. The extraction efficiency,contents of total phenol and flavonoid were determined. The scavenging abilities of free radicals,metal chelating capacity(MCC)and ferric reducing antioxidant power(FRAP)of the three extracts were also investigated. Results showed that the order of extraction efficiency and total phenol content was as follows:water>70% methanol>70% ethanol,while the order of total flavonoid was the opposite. The three extracts obtained by three solvents all possessed excellent DPPH·,ABTS+· and ·OH radicals scavenging abilities,MCC and FRAP. 70% methanol was chosen as the most appropriate solvent for the extraction of papaya leaf. The research here not only provided experimental basis for the usage of papaya leaf in the synthesis of natural antioxidants,but also improved the overall value of papaya.

papaya leaf;solvents;extract;antioxidant abilities

2017-04-18

劉玉革(1977-)，女，博士，副研究員，研究方向：功能成分提取與利用， E-mail:liuyugehb@126.com。

*

張秀梅(1975-)，女，博士，研究員，研究方向：功能成分提取與利用， E-mail:asiazhang1975@163.com。

中央級公益科研院所基本科研業務費專項：食品營養成分的挖掘與利用(1630062017034)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0012-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.003