qPCR檢測結核桿菌在肺和胸膜上皮樣肉芽腫性疾病診斷中的意義

陳 昕，陳靈鋒，黃 穎

qPCR檢測結核桿菌在肺和胸膜上皮樣肉芽腫性疾病診斷中的意義

陳 昕，陳靈鋒，黃 穎

目的探討熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法在診斷及鑒別診斷肺和胸膜結核病和其他肉芽腫性疾病中的意義。方法收集經病理學檢查發現上皮樣肉芽腫性病變的肺和胸膜活檢的石蠟包埋組織142例，應用qPCR法檢測結核分枝桿菌DNA，同時行抗酸染色，并與臨床資料對比進行回顧性分析。結果在142例肺胸膜活檢標本中，60例臨床診斷確診為結核病。采用qPCR法檢測結核分枝桿菌DNA陽性者58例，敏感性為96.67%，特異性為100%；抗酸染色陽性者17例，敏感性為28.33%，特異性為97.56%，差異有統計學意義(χ2=21.47，P<0.001)。結論結核分枝桿菌核酸檢測有助于在石蠟包埋的肺和胸膜小活檢組織中快速、準確的診斷結核病，可用于疑似結核的肉芽腫性病變的鑒別診斷。

結核；分枝桿菌；福爾馬林固定石蠟包埋組織；熒光定量聚合酶鏈反應

結核是一種由結核分枝桿菌引起的傳染病，近年來發病率呈增高趨勢。早期診斷并及時治療是控制結核病疫情的關鍵，因此，準確、快捷、簡便的檢測方法具有十分重要的意義。常規病理確診結核病，除了觀察其特征性肉芽腫性病理改變，還需找到結核分枝桿菌。病理科常規開展齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法尋找病原菌，但抗酸染色普遍檢出率低。近年來，熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time polymerase chain reaction, qPCR)法逐漸應用于臨床檢驗，常用于痰液檢測，也陸續見有報道用于病理石蠟包埋組織。本實驗組在一組疑似結核的活檢石蠟組織中同時采用qPCR法和抗酸染色進行檢測，旨在評價兩種方法在輔助病理確診結核病中的價值與意義。

1 材料與方法

1.1一般資料選取福建省立醫院2013年1月～2015年12月期間肺、縱隔活檢組織經病理檢查顯示上皮樣肉芽腫性病變、需排除結核病的石蠟包埋組織142例。其中肺、支氣管活檢組織99例，胸膜活檢組織32例及縱隔活檢組織11例(圖1)。其中男性73例，女性69例，年齡14～77歲，平均年齡44歲。所有病例均同時采用qPCR法檢測結核桿菌DNA，結合Ziehl-Neelsen抗酸染色檢查輔助診斷。本組142例肺、胸膜及縱隔活檢組織中，臨床確診為結核病60例，非結核病82例。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 QIACUBE全自動核酸純化儀(Qiagen公司，德國)；Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀(Qiagen公司，德國)。

1.2.2試劑 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat.56404, Qiagen公司，德國)；結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)[國食藥監械(準)字2009第3400575號]。

1.3方法

1.3.1qPCR 每例活檢石蠟組織10 μm厚切片8片，提取DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度和OD值(A260/A280比值在1.6～2.0間的為合格樣本)。PCR擴增結核分枝桿菌特異插入片段IS6110。反應體系為40 μL(結核PCR反應液37.8 μL、Taq酶0.2 μL、UNG酶0.06 μL)；反應條件：37 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每批樣本均設陽性對照、臨界陽性對照及陰性對照，對照品均來源于試劑盒中的對照質粒DNA。結果判定：檢測樣本Ct值=40時，判為陰性；Ct值≤37.0時，判為陽性；Ct值介于37.0和40之間時，建議復檢，復檢結果Ct值<40者，判為陽性。

1.3.2抗酸染色 石蠟組織4 μm厚切片，常規二甲苯脫蠟至水；滴加苯酚堿性品紅液37 ℃孵育15～30 min，水洗；滴加分化液分化數秒，充分水洗；滴加Mayer蘇木精孵育30 s；流水沖洗10～15 min，干燥、透明、封固。結果判定：結核桿菌抗酸染色陽性，呈鮮紅色；其他細菌及細胞呈藍色。高倍鏡下連續觀察300個視野，未發現抗酸桿菌者，判為陰性；找到1～8條抗酸桿菌/300視野，判為可疑陽性(±)；找到>3條抗酸桿菌/100視野，判為陽性。

1.4統計學處理應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析，以臨床診斷結果為金標準，分別計算靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值等。配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1抗酸染色法檢測結核分枝桿菌19例抗酸染色結果為陽性，總體陽性率為13.38%(表1)；在60例臨床確診為結核病的活檢組織中，17例抗酸染色陽性，敏感性為28.33%，特異性為97.56%，準確性為68.31%(圖2)。

①A①B②A②B

圖1肺和胸膜活檢組織的上皮樣肉芽腫性炎性病變：A.肺活檢組織；B.胸膜活檢組織，低倍鏡下均呈慢性肉芽腫性炎性改變圖2抗酸染色結果：A病例抗酸染色可見多量抗酸抗菌(藍色箭頭)；B病例抗酸染色為陰性

2.2qPCR法檢測結核分枝桿菌142例疑似結核的肺、胸膜及縱隔活檢組織標本中，58例結核桿菌核酸qPCR反應為陽性，總體陽性率為40.9%(圖3)。在60例臨床確診為結核病的活檢組織中，qPCR檢測58例為陽性，2例為陰性，敏感性為96.67%，特異性為100%，準確性為98.59%(表1)。

本組142例肺、胸膜及縱隔活檢組織標本中，17例qPCR和抗酸染色檢測結核分枝桿菌均陽性，82例均陰性，符合率為69.72%(表2)。對兩種方法進行Kappa檢驗，Kappa=0.301(P<0.001)，兩者具有較好地吻合性。qPCR法敏感性高于抗酸染色法，差異有統計學意義(χ2=21.468，P<0.001，表1)。

表1 142例活檢標本qPCR與抗酸染色檢測結核分枝桿菌的結果

表2 抗酸染色與qPCR法檢測結核分枝桿菌結果的一致性比較

圖3 qPCR檢測結果

A.圖2A病例的qPCR檢測結果示結核桿菌呈陽性；B.圖2B病例的qPCR檢測結果呈陰性

3 討論

我國結核病防治形勢很嚴峻，發病率高居全球第3位，而且耐多藥結核病的疫情嚴重[1]。2007～2008年全國結核菌耐藥性基線調查結果顯示，我國肺結核患者中多藥耐藥率為8.32%，每年新發耐藥的結核患者約為12萬例，占全球每年新發病例總數的24%，位居全球的第2位[2]。2010年第五次全國結核病流行病學調查顯示，一線抗結核藥物耐藥率為36.8%，二線抗結核藥物耐藥率為24.6%，總耐多藥率為6.8%[1]。

結核病的特征性病理學改變是肉芽腫性病變伴有干酪樣壞死。但結核的病理特征在HE染色中不具有特異性，很難與結節病及真菌感染等肉芽腫性疾病鑒別，一直以來病理科應用Ziehl-Neelsen抗酸染色尋找結核桿菌，與其他肉芽腫性疾病鑒別診斷，是病理學診斷結核病的一種首選的輔助手段。然而抗酸染色的特異性具有局限性，除了結核分枝桿菌外，其它一些引起人、畜共感染的桿菌，如牛分枝桿菌、禽分枝桿菌以及麻風桿菌等感染人體后均可呈肉芽腫性炎改變，或可伴干酪樣壞死，并且抗酸染色均呈陽性[3]。因此，如果僅憑病理組織學形態和抗酸染色結果診斷，有可能將其他分枝桿菌感染誤診為結核。

qPCR技術是在傳統PCR反應中引入熒光標記探針，操作步驟簡單，又消除了非特異性擴增，從擴增到檢測的全程 “閉管”操作，避免產物污染，大幅度降低了假陽性率。結核分枝桿菌3個序列常被選作目的擴增片段：16SrRNA、rpoB和IS6110，其中IS6110插入序列是結核分枝桿菌群特異序列[4-5]。本實驗選用的試劑盒擴增結核分枝桿菌的特異序列IS6110。在本組病例中，qPCR法檢測結核分枝桿菌顯示出高度的敏感性及特異性，其敏感性遠遠高于抗酸染色法。

小活檢組織病理診斷結核病更具挑戰性，抗酸染色查找結核桿菌陽性率低，容易造成漏診。迄今少有肺及胸膜活檢組織中結核病診斷的大病例數報道。本組納入142例疑似結核的肺、胸膜及縱隔活檢組織，同時采用抗酸染色和qPCR法檢測結核分枝桿菌進行輔助診斷。結合臨床資料回顧性分析，臨床確診為結核病的60例中，qPCR檢測陽性率為96.67%，抗酸染色陽性率為28.33%，qPCR法檢測結核分枝桿菌敏感性明顯高于抗酸染色法。抗酸染色及qPCR法檢測核酸桿菌均具有很高的特異性，qPCR特異性為100%，抗酸染色特異性為97.56%。qPCR法檢測核酸桿菌的陽性率高于以往54.6%[5]、64.6%[6]的報道。抗酸染色檢測結核桿菌的陽性檢出率普遍偏低，文獻報道不一，本組病例抗酸染色陽性率為28.33%，低于既往51.3%[5]、39.8%[7]的報道，但接近于兩組30.5%及32.5%的陽性率[6,8]。

分析本組病例抗酸染色陽性率偏低的可能原因：(1)可能由于本組病例為小活檢組織，檢出率受限于是否活檢到包含結核桿菌的組織；但基于配對的qPCR反應顯示很高的陽性率，提示本組病例的抗酸染色操作和評判可能存在不足。(2)活檢組織僅含極少數的抗酸桿菌于鏡下觀察時被忽略。(3)認為抗酸染色的操作很可能是導致本組抗酸染色檢出率低更為重要的原因。

抗酸染色的原理是加熱條件下使分枝桿菌與石碳酸復紅結合成復合物系鹽酸乙醇處理不易脫色的牢固性結合，經堿性美蘭復染后，分枝桿菌依然呈紅色，突顯于藍色背景中。但在實際操作中由于各種原因，抗酸染色結果不太穩定，尤其在石蠟組織病理切片中的抗酸菌染上色后容易被鹽酸乙醇脫色，導致假陰性，造成陽性率較低。孔潔等[9-10]對傳統抗酸染色進行了改良，通過提高石蠟切片厚度；促染劑提高抗酸菌的被染色率；改良脫蠟液增加染色后抗酸菌的抗酸性，以及進一步優化背景染色，改良后的抗酸染色陽性率明顯優于傳統的抗酸染色法。

本組實驗結果顯示，在肺、胸膜活檢組織中采用qPCR法檢測結核分枝桿菌具有很高的敏感性及特異性，在輔助結核病的診斷中展示出良好的應用前景。

[1] 鄭惠文, 趙雁林. 中國結核病耐藥監測現狀與監測體系建設[J]. 中國實用內科雜志, 2015,35(8):647-650.

[2] 廖 麗. 我國結核病流行現狀及防治工作形勢分析[J]. 中外醫療, 2014,3:129-130.

[3] 孫泉云, 王根龍, 陳 琦. 野生動物結核病研究進展[J]. 動物醫學進展, 2010,31(8):93-97.

[4] Seagar A L, Neish B, Laurenson I F. Comparison of two in-house real-time PCR assays with MTB QPCR alert and genoType MTBDRplus for the rapid detection of mycobacteria in clinical specimens[J]. J Med Microbiol, 2012,61(10):1459-1464.

[5] 葉 豐, 陳 昱, 何 度, 等. 應用熒光定量聚合酶鏈反應對疑似結核組織的DNA分析[J]. 中華病理學雜志, 2013,42(8):534-537.

[6] 羅春英, 王建東, 王 璇, 等. 熒光定量聚合酶鏈反應檢測石蠟包埋組織結核桿菌的應用價值[J]. 中華病理學雜志, 2012,41(8):562-563.

[7] 孫亞欣, 張志超, 董美玲, 等. 108例結核病變組織抗酸染色結果分析[J]. 中國實用診斷學, 2011,15(9):1586-1587.

[8] 曹燕珍, 胡佳捷, 王翠翠, 等. 實時熒光定量PCR在結核病中的診斷價值[J]. 醫學理論與實踐, 2015,28(23):16-17.

[9] 孔 潔, 謝惠康, 陳 崗. 一種在石蠟切片中應用的改良抗酸染色法的要點及解析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2012,28(9):1062-1063.

[10] 王 弦, 吳 強. 石蠟組織切片抗酸染色方法的改良體會[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(10):1183-1184.

R 521； R 561

A

1001-7399(2017)10-1132-03

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.017.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.017

接受日期：2017-07-27

國家青年自然科學基金(81201794)、福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目(2015-ZQN-ZD-3)、福建省自然科學基金(2012J01117)、福建省醫學創新課題(2012-CX-3)

福建省立醫院病理科/福建省立臨床醫學院，福州 350001

陳 昕，女，技師。E-mail: 729039151@qq.com

黃 穎，女，博士，副主任醫師，通訊作者。E-mail: huang_ying11@hotmail.com