不同產地博落回離體培養與植株再生研究△

徐敏，宋錫帥，黃鵬，唐其，唐昭山，劉薇，3*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學分析測試中心，湖南 長沙 410128)

·中藥農業·

不同產地博落回離體培養與植株再生研究△

徐敏1，宋錫帥1，黃鵬1，唐其1，唐昭山2，劉薇1，3*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學分析測試中心，湖南 長沙 410128)

目的探索不同產地的博落回離體培養效果差異，為篩選最適博落回植株再生材料提供研究基礎。方法采用植物組織培養技術對博落回葉片組織進行愈傷誘導及胚狀體分化，并對結果進行分析。結果安徽祁門、湖南炎陵和湖南高坊產地分別在不同培養階段與其他產地比誘導率和分化率最高。結論湖南高坊和安徽祁門的愈傷組織和胚狀體的誘導及分化能力優于其他產地的樣本。因此，不同產地葉片離體培養效果差異顯著。

博落回，體細胞胚胎發生，離體培養，植株再生

血根堿(sanguinarine，SAN)屬于芐基異喹啉類生物堿(BIAs)，主要分布于罌粟科等植物中[1]。SAN具有調節畜禽類腸道菌群和抗炎促生長的作用，已作為飼用抗生素的替代品在歐洲等地區廣泛銷售[2]。目前血根堿只能從植物中提取，主要來源于博落回Macleayacordata(Willd.) R.Br.。該植物屬于罌粟科博落回屬植物，主要分布于中國、東亞、北美洲和歐洲[3]。隨著2006年歐盟全面禁止在飼料中添加抗生素使得市場對血根堿的需求逐年增長，而博落回作為血根堿的主要來源植物因野生資源連年大規模的人工采集后嚴重影響到了野生資源可采收量。因此，我們找到一種新的血根堿來源的資源獲取途徑是一個值得關注的技術。

植物組織培養是以細胞的全能性以及植物的再生作用為理論基礎建立的一種離體培養技術。植物體細胞胚胎發生是植物組織或細胞在離體條件下，通過培養條件誘導不斷產生非合子胚，并萌發成完整植物體的形態發生過[4]。植物體細胞胚胎發生技術已經被用于多種藥用植物次生代謝產物生產，如西洋參、刺五加、半夏、鐵皮石斛等[5-7]。通過該方法能夠獲得遺傳相對穩定的再生植株并且能夠為遺傳轉化和人工種子制作提供理想的實驗體系。

本實驗室前期通過對8個不同產地的博落回花藥進行組織培養并對誘導產生單倍體植株的因素進行研究，建立了穩定高效的博落回花藥離體培養以及植株再生體系[8]。同時，我們在對博落回全基因組測序植株進行離體培養時發現不同產地來源的博落回葉片的愈傷誘導率具有明顯差異，而這一現象在其他植物中也有報道[9]。為了深入研究該現象，我們以8個不同產地的博落回葉片作為外植體進行組織培養，并對其葉片誘導成愈傷組織、愈傷組織分化成胚狀體以及胚狀體分化成苗的現象進行分析，為完善博落回體細胞胚胎發生體系提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養基配方

供試材料為不同產地的博落回葉片及對應編號見表1，均采自湖南農業大學國家中藥材生產(湖南)技術中心的博落回種質資源圃。由來自8個不同產地的野生博落回葉片經組織培養后而產生的博落回再生植株。不同類型培養基配方見表2。

表1 博落回產地來源編號

表2 培養基配方

注：+代表已添加該試劑，-代表未添加該試劑。

1.2 外植體培養的過程

從健康博落回植株上采集葉片，放入自封袋并置于采樣盒內，然后置于4 ℃的冰箱中冷藏3 d。取出用無菌水浸泡30 min，75%酒精浸泡10 s，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1%的HgCl2(升汞)浸泡7 min，最后用無菌水沖洗5次。在超凈工作臺下將葉片剪成約0.5×0.5 cm2見方，然后將其接種到愈傷誘導培養基上，每皿接種9個葉片，每個產地接種30皿，放在光照強度2000 lx、光照時間16 h·d-1、恒溫25 ℃的恒溫培養箱中進行培養。經過40 d的誘導培養后，統計其愈傷誘導率，然后將形態健康的愈傷組織接種在增殖培養基上進行繼代增殖，每隔10 d繼代一次，繼代2次后將初步形成的愈傷組織分別接種在胚狀體誘導培養基和分化培養基上，每皿接種6塊愈傷組織，每個產地接種30皿，放在光照強度2000 lx、光照時間16 h·d-1、恒溫25℃的光照培養箱中進行培養，接種在培養基上20 d后統計其出胚率及分化率，每個產地均重復三次。

1.3 實驗觀察及記錄

在相應的培養基上培養一定時間后，統計愈傷誘導率、胚狀體發生率、分化率。相應的計算公式如下：

1.4 數據統計與分析方法

對不同產地的愈傷誘導率、胚狀體發生率以及分化率數據使用SPSS 19.0軟件分別進行統計學分析。采用3次重復實驗數據的平均值±標準差并對結果用Duncan’s multiple range test(鄧肯多個范圍測試)方法進行分析，同一列不同字母表示顯著性差異。

2 結果

2.1 不同產地葉片愈傷誘導率差異分析

博落回葉片經培養基誘導后產生愈傷組織(圖1)。表3為8個不同產地葉片的愈傷誘導率。結果顯示，在所有8個產地中，安徽祁門(MCQ)的愈傷誘導率最高，達到了約44.9%；湖南高坊(MCG)其次，其愈傷誘導率約為39.4%；貴州凱里(MCL)的愈傷誘導率最低，只達到了約9.6%；另外，編號為福建光澤(MCZ)和貴州松桃(MCS)的葉片未能誘導出愈傷組織。

表3 不同產地來源的博落回葉片愈傷誘導率比較

注：采用3次重復實驗數據的平均值±標準差并對結果用Duncan’s multiple range test 方法進行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖1 葉片誘導成愈傷組織

2.2 不同產地來源對胚狀體誘導的影響

博落回愈傷組織經誘導培養成胚狀體(圖2)。編號為浙江開化(MCK)、湖南高坊(MCG)、貴州凱里(MCL)、安徽祁門(MCQ)、湖南炎陵(MCY)、重慶秀山(MCX)的愈傷組織經過一段時間培養均有胚狀體產生(表4)。其中胚狀體發生率最高的是湖南炎陵(MCY)，達到了約39.4%，重慶秀山(MCX)的胚狀體發生率最低，僅約為15.4%。

表4 不同產地來源的博落回胚狀體發生率比較

注：采用3次重復實驗數據的平均值±標準差并對結果用Duncan’s multiple range test 方法進行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖2 愈傷組織培養成胚狀體

2.3不同產地來源愈傷組織分化成不定芽的影響

博落回愈傷組織分化成不定芽(圖3)。6份供試材料中所形成的愈傷組織經過分化培養基的培育，均發現了不同程度的不定芽產生，但是總體而言其分化成不定芽的幾率都小于通過胚狀體途徑進行分化。通過表5可以知道，不同產地來源的博落回的愈傷組織分化成苗的能力是不相同的。其中分化率最高的是湖南高坊(MCG)，約為21.5%，分化率最低為重慶秀山(MCX)，僅約為3.6%。

表5 不同產地來源的博落回愈傷組織分化率比較

注：采用3次重復實驗數據的平均值±標準差并對結果用Duncan’s multiple range test 方法進行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖3 為愈傷組織分化成不定芽

2.4 不同產地來源對胚狀體分化成不定芽的影響

博落回胚狀體分化成不定芽(圖4)。通過表6可知，通過胚狀體發生的途徑得到不定芽的幾率都比較高，即便是分化率最低的貴州凱里(MCL)其分化率都達到了約54.4%，湖南高坊(MCG)的胚狀體的分化率甚至高達約91.4%，其他產地來源的博落回組培產生的胚狀體的分化率基本上都達到了50%以上。

表6 不同產地來源的博落回胚狀體分化率比較

注：采用3次重復實驗數據的平均值±標準差并對結果用Duncan’s multiple range test 方法進行分析，同一列不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3)小寫字母代表是在0.05水平下比較，差異顯著。

圖4 為胚狀體分化成不定芽

3 討論

博落回具有較好的藥用價值和廣闊的市場前景，利用植物組織培養等技術對博落回資源的可持續開發及研究具有重要的意義。本課題組在前期研究中已實現博落回植株再生、快繁以及花藥離體培養并初步建立了博落回遺傳轉化體系[8，10]，為下一步的博落回單倍體育種及分子育種提供了前期基礎。本研究在前期研究基礎上進一步對不同產地的博落回葉片離體培養效果差異進行研究，發現不同產地葉片在不同階段的離體培養效果差異顯著。其中MCQ產地在第一階段(葉片誘導產生愈傷)中誘導率最高；MCY在第二階段(愈傷到胚狀體階段的胚狀體)中胚狀體發生率最高；而MCG在另外兩個階段(愈傷組織分化成不定芽和胚狀體分化成不定芽階段)中分化率最高。這種差異現象的發生可能是由于不同產地的博落回基因型不同導致的。在其他物種中，研究人員發現[11-14]在不同基因型的草莓離體葉片中不定芽誘導再生率差異顯著。除了草莓以外，不同基因型對于辣椒的花藥離體培養胚狀體誘導率具有決定性的影響[15]。雖然本實驗對不同產地博落回葉片的離體培養效果進行了初步探索但是并未關注每個階段的增殖率，所以下一步將對不同產地的博落回組培的愈傷組織及胚狀體的增殖率進行研究。同時，本實驗僅對博落回葉片組織進行離體培養，而未對莖段，葉柄，根等部位進行離體培養，因此下一步將對這些部位的離體培養效果進行探討。另外，對于造成不同產地博落回離體培養效果差異的原因及其機制將在下一步的實驗中進行探討。

[1] Zeng J，Liu Y，Liu W，et al.Integration of transcriptome，proteome and metabolism data reveals the alkaloids biosynthesis in Macleaya cordata and Macleaya microcarpa[J].PLoS One，2013，8(1)：e53409.

[2] Windisch W，Schedle K，Plitzner C，et al.Use of phytogenic products as feed additives for swine and poultry[J].J Anim Sci，2008，86(14 Suppl)：E140-E148.

[3] 劉秀斌.博落回屬植物中生物堿代謝累積研究[D].長沙：湖南農業大學，2012.

[4] 陶雷.刺五加體細胞胚發生機制的初步研究[D].黑龍江：東北林業大學，2013.

[5] Manoharan Rajesh G S K S.Establishment of somatic embryogenesis and podophyllotoxin production in liquid shake cultures of Podophyllum hexandrum Royle[J].Industrial Crops and Products，2014，60(1)：66-74.

[6] 江艷華.半夏規范化種植關鍵技術及組培快繁體系建立的研究[D].北京：北京協和醫學院，2013.

[7] 羅成科，彭正松，陳衛民.三葉半夏懸浮培養下的體細胞胚胎發生及植株再生[J].西北植物學報，2006，126(4)：842-846.

[8] 宋錫帥，彭瓊，柳亦松，等.博落回花藥離體培養及植株再生研究[J].湖南農業科學，2014(7)：28-31.

[9] 張建瑛，許傳玲，沈海龍，等.不同產地花楸樹愈傷組織誘導和體胚發生比較分析[J].北方園藝，2014(13)：102-105.

[10] 卓奕秀，柳亦松，謝紅旗，等.博落回遺傳轉化體系的初步建立[J].生命科學研究，2016，20(3)：224-229.

[11] 吳雪梅，湯浩茹.草莓葉片培養研究進展[J].北方園藝，2004，21(6)：8-10.

[12] 鄧馨，胡文玉.草莓葉片再生芽及遺傳轉化系統的建立[J].植物學通報，2000，17(2)：174-178.

[13] Passey A J，Barrett K J，James D J.Adventitious shoot regeneration from seven commercial strawberry cultivars (Fragaria x ananassa Duch.) using a range of explant types[J].Plant Cell Rep，2003，21(5)：397-401.

[14] Passey A J，Barrett K J，James D J.Adventitious shoot regeneration from seven commercial strawberry cultivars (Fragaria x ananassa Duch.) using a range of explant types[J].Plant Cell Rep，2003，21(5)：397-401.

[15] 孫少霞，戈偉，王述彬，等.甜(辣)椒花藥培養胚狀體誘導與植株再生[J].江蘇農業學報，2009，25(6)：1330-1334.

StudyonVitroCultureandPlantRegenerationofMacleayacordata

XU Min1，SONG Xishuai1，HUANG Peng1，TANG Qi1，TANG Zhaoshan2，LIU Wei1，3*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.MicolltaBioresourceInc，Changsha410128，China；3.CenterOfAnalyticServiceHunanAgricultureUniversity，Changsha410128，China)

Objective：To explore the differenle of different regions vitro culture ofMacleayacordataand provide data for screening the optimal plant regeneration materials.MethodsThe leaves ofM.cordatawere isolated to callus induction and differentiation of leaves into embryos by using plant cell culture technology and the results differentiation was analyzed.ResultsThe samples from Qimen of Anhui，Yanling of Hunan and Gaofang of Hunan had the highest induction and differentiation rate compared with others in different periods.ConclusionThe induction and the differentiation ability of callus and embryos bodies from Gaofang of Hunan and Qimen of Anhui were superior to those from other regions.Therefore，the vitro culture effect of leaves from different regions was significant difference.

Macleayacordata，somatic embryo genesis，vitro culture，plant regeneration

湖南省科技重點計劃(2016SK3002)；湖南省教育廳科學研究項目(16C0769)；博落回血根堿/白屈菜紅堿生物合成關鍵酶-P6H的功能研究(2016JJ4040)

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劉薇，實驗師，研究方向：化學成分分析與檢測；Tel：(0731)84673824 E-mail：37892293@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.014

2017-02-20)