在模擬人工胃腸道環境中博落回主要生物堿類成分的穩定性特征分析△

張換成，陳梅，柳亦松，唐昭山，曾建國*，劉兆穎*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 動物醫學院，湖南省獸藥工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·基礎研究·

在模擬人工胃腸道環境中博落回主要生物堿類成分的穩定性特征分析△

張換成1，2，陳梅1，2，柳亦松1，2，唐昭山3，曾建國1，2*，劉兆穎1，2*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 動物醫學院，湖南省獸藥工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

目的為解釋博落回中4個生物堿(原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿)生物利用低的原因，對這四個生物堿在模擬人工胃腸道環境下的穩定性進行考察。方法采用HPLC測定博落回中4個生物堿在不同pH緩沖液、人工胃液(pH=1.3)和人工腸液(pH=6.8)中的穩定性。結果原阿片堿和別隱品堿在酸性、中性、堿性、人工胃液及人工腸液環境下8 h回收率為97.16%～101.89%；血根堿在pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水、pH=7.8～8.0 磷酸鹽緩沖液及人工腸液中8 h回收率為48.81%～60.53%；白屈菜紅堿在pH=5.8磷酸鹽緩沖液、pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水及人工腸液中8 h的回收率為81.21%～93.48%；在pH=7.8～8.0 磷酸鹽緩沖液中8 h回收率為57.43%。結論原阿片堿和別隱品堿的穩定性不受pH的影響，血根堿和白屈菜紅堿隨pH升高穩定性降低，博落回中4個生物堿在模擬人工胃腸道環境中的穩定性結果與其在不同pH環境中一致，為闡明博落回散在體內的藥代動力學特點提供科學依據。

博落回；血根堿；白屈菜紅堿；胃腸道穩定性

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.屬于罌粟科博落回屬植物，主要分布于中國西北以及西南部、東南亞、北美洲和歐洲，在中國已有1000多年的用藥歷史[1]。國內外研究表明，博落回具有抗菌[2]、殺蟲[3-5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7-9]、改善肝功能和增強免疫力[10]、調節腸道菌群[11]、抗血小板聚集[12]等作用。博落回已被開發為不同的產品，廣泛應用于家禽疾病治療、飼料添加、生物殺蟲、能源調節等領域[13]。長久以來，國內外學者對博落回的研究主要集中在其化學成分和藥理作用[14]，博落回中生物堿的胃腸道穩定性研究少見報道。目前國內外文獻報道了約30個博落回生物堿[13]，其中4個主要生物堿(原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿)具有顯著生物活性[15]。有文獻報道，血根堿在給藥后，主要分布在腸道，生物利用度偏低[16]。在不同pH介質中，血根堿存在亞胺型(SA+)和烷基醇胺型(SAOH)兩種形式，pH小于6時主要以亞胺型(SA+)存在[17-18]。本實驗室懷疑血根堿生物利用度低與胃腸道的pH值有關，因此本文采用離體實驗法[19-20]分別考察博落回中原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿在不同pH緩沖液、人工胃液、人工腸液中的穩定性，為闡明博落回中4個生物堿的藥物代謝動力學提供科學依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Agilent 5 TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AE240型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；HERMLE Z323K型低溫高速離心機(德國Hermle公司)；Milli-Q Advantage A10系統(美國MILLPORE公司)。

原阿片堿(純度>98%)、別隱品堿(純度>98%)、血根堿(純度>95%)和白屈菜紅堿(純度>95%)由湖南美可達生物資源有限公司提供；胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶(1∶250)，購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

參照本實驗室方法[21]改進。色譜柱：Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%甲酸溶液，按程序洗脫(0～14 min，乙腈25%；14～27 min，乙腈25%～60%；27～29 min，乙腈60%～25%；29～35 min，乙腈25%)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：284 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 穩定性考察

2.2.1 儲備液的配制 分別精密稱取原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿5.0 mg，置于50 mL容量瓶內，用甲醇溶液定容。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 不同pH溶劑制備 按照《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄，配制pH=1鹽酸液、pH=2.5磷酸鹽緩沖液、pH=5.8磷酸鹽緩沖液、pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水、pH=7.8～8.0磷酸鹽緩沖液。

2.2.2.2 供試液制備 精密移取儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，分別加入上述6種溶液，定容，搖勻，置37 ℃恒溫水浴鍋，分別于0、0.5、1、2、4、6、8 h取樣0.8 mL置于2.0 mL離心管中，加入0.8 mL甲醇，混合，搖勻，離心(12 000 r·min-1)1 min，上清液過0.22 μm微孔有機濾膜。

2.2.2.3 實驗方法 取上述供試液按照2.1項下條件進行HPLC分析。

2.2.3 人工胃液和人工腸液

2.2.3.1 人工胃液制備 取濃鹽酸9 mL，加至800 mL超純水中，用1 mol·L-1鹽酸調節pH值至1.3；取胃蛋白酶10.0 g溶于100 mL超純水。兩液混合，搖勻，加超純水稀釋至1000 mL。

2.2.3.2 人工腸液制備 精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加超純水溶解至500 mL，用0.4%氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8；取胰蛋白酶10.0 g溶于100 mL超純水。兩液混合，搖勻，加超純水稀釋至1000 mL。

2.2.3.3 供試液制備 同2.2.2項下，加入溶液為人工胃液和人工腸液。

2.2.3.4 實驗方法 取上述供試液按照2.1項下條件進行HPLC分析。

2.3 數據處理

用回收率表示生物堿的穩定性，用單點校正法計算回收率，HPLC分析后記錄各生物堿峰面積，按公式(1)計算生物堿回收率。

(1)

3 結果

3.1 博落回中4個生物堿在不同pH條件下的穩定性結果

由圖1可知，原阿片堿和別隱品堿在pH=1鹽酸液、pH=2.5磷酸鹽緩沖液、pH=5.8磷酸鹽緩沖液、pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水、pH=7.8～8.0磷酸鹽緩沖液中8 h的回收率為97.16%～101.89%。由此可得，原阿片堿和別隱品堿的穩定性不受pH影響，在酸性、中性、堿性條件下均穩定。

血根堿在pH=1鹽酸液、pH=2.5磷酸鹽緩沖液中8 h的回收率為100.30%～100.60%；在pH=5.8磷酸鹽緩沖液中8 h的回收率為86.63%；在pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水、pH=7.8～8.0磷酸鹽緩沖液中8 h回收率為48.81%～57.14%。由此可得，血根堿的穩定性受pH影響，血根堿在酸性條件下較穩定，在中性和堿性條件下不穩定。

白屈菜紅堿在pH=1鹽酸液、pH=2.5磷酸鹽緩沖液中8 h的回收率為99.75%～100.02%；在pH=5.8磷酸鹽緩沖液、pH=6.8磷酸鹽緩沖液、水中8 h的回收率為81.21%～93.48%；在pH=7.8～8.0磷酸鹽緩沖液中8 h回收率為57.43%。由此可得，白屈菜紅堿的穩定性受pH影響，白屈菜紅堿在酸性和中性條件下較穩定，在堿性條件下不穩定。

3.2 博落回中4個生物堿在模擬胃腸道環境中的穩定性結果

由圖2可知，博落回中4個生物堿在人工胃液中8 h的回收率為99.04%～101.13%，由此可得，博落回中4個生物堿在人工胃液中均穩定。這主要與人工胃液的pH值有較大關系，試驗結果與4個生物堿在不同pH溶液中的穩定性結果一致。

原阿片堿和別隱品堿在人工腸液中8 h的回收率為97.76%～100.50%；白屈菜紅堿在人工腸液中8 h的回收率為87.89%；血根堿在人工腸液中8 h的回收率為60.53%。由此可得，原阿片堿和別隱品堿在人工腸液中均穩定；白屈菜紅堿在人工腸液中較穩定；血根堿在人工腸液中不穩定。這主要與人工腸液的pH有較大關系，實驗結果與4個生物堿在不同pH溶液中的穩定性結果一致。

注：A.原阿片堿；B.別隱品堿；C.血根堿；D.白屈菜紅堿。圖1 博落回中4個生物堿在不同pH條件下的穩定性結果

注：A.人工胃液；B.人工腸液。圖2 博落回中4個生物堿在模擬人工胃腸道環境中的穩定性結果

4 討論

藥物的溶解性、穩定性、膜通透性和首過作用等生物藥劑學性質是影響藥物口服后經胃腸道吸收的主要因素。藥物在胃腸道中的穩定性直接影響消化道內的母體藥物量。消化液中的藥物有可能因其在胃腸道的不穩定性而發生化學降解或者酶降解以及在腸道下段被腸內細菌菌叢代謝，從而使得母體藥量減少，降低生物利用度[22]。

本實驗結果顯示，博落回4個生物中原阿片堿和別隱品堿的穩定性不受pH影響，在酸性、中性、堿性條件下均穩定；而血根堿和白屈菜紅堿的穩定性均受pH影響。血根堿在酸性條件下較穩定，在中性和堿性條件下不穩定，白屈菜紅堿在酸性和中性條件下較穩定，在堿性條件下不穩定。結果與文獻報道一致[17-18]。同時，博落回中4個生物堿在模擬胃腸道環境中的穩定性結果和其在不同pH條件下的結果一致。

有研究表明，食物在胃內停留時間為1～2 h，最長達4 h，飯前pH=1～3.5，飯后pH最高達5；食物在小腸內停留時間為3～8 h，pH=6.4～7.4[23-24]，營養成分的吸收主要在小腸段。血根堿和白屈菜紅堿在胃液中主要以離子形式(SA+)存在，不易被吸收；血根堿和白屈菜紅堿在小腸液中主要以分子形式(SAOH)存在，其堿基是親脂性的，所以比較容易通過親脂擴散方式被腸道吸收[25]。本實驗結果表明，血根堿和白屈菜紅堿在人工胃液中穩定，在人工腸液中不穩定，導致其吸收減少，這也可能是血根堿和白屈菜紅堿生物利用度較低的原因。

本文采用離體實驗法考察博落回中4個生物堿在不同pH緩沖液、人工胃液、人工腸液中的穩定性，對進一步研究博落回中4個生物堿的吸收代謝情況及成藥后的劑型設計有一定的指導意義，對解釋其藥代動力學特點有重要作用。

[1] Sai C M，Li D H，Xue C M，et al.Two pairs of enantiomeric alkaloid dimers fromMacleayacordata[J].Org Lett，2015，17(16)：4102-4105.

[2] 王朝元，童勝蘭，胡鑫.博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究[J].中南民族大學學報(自然科學版)，2015，34(1)：39-42.

[3] 張勝菊，柯治國，南玉生.博落回抽提物對黃守瓜、菜青蟲的田間藥效評價[J].華中農業大學學報，2003，22(5)：450-451.

[4] 陳昭存，宋清，王素俠，等.博落回防治梨木虱和二斑葉螨藥效試驗[J].果農之友，2003(8)：30.

[5] 袁濤忠，張華生.博落回殺滅蠅蛆效果的實驗觀察[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1999，17(2)：66.

[6] Pi G，Ren P，Yu J，et al.Separation of sanguinarine and chelerythrine inMacleayacordata(Willd)R.Br.based on methyl acrylate-co-divinylbenzene macroporous adsorbents[J].J chromatogr A，2008，1192(1)：17-24.

[7] 龐建新，馬仁強，劉蘭梅，等.博落回總堿對肝癌細胞的毒性作用和體內抗腫瘤作用[J].第一軍醫大學學報，2005，25(3)：325-328.

[8] 樊淑蓮，焦峰，張園，等.博落回總生物堿對動物移植性腫瘤的作用研究[J].陜西腫瘤醫學，2000，8(3)：174-149.

[9] 潘岳華.博落回汁治愈腫瘤一例[J].湖北中醫雜志，1991，13(3)：48.

[10] 楊軍，王靜，劉信順，等.博落回的藥效研究[J].中藥材，1999，22(2)：82-85.

[11] Stiborova M，Vostalova J，Zdarilova A，et al.Macleaya cordata extract and Sangrovit genotoxicity.Assessment in vivo[J].Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky，Olomouc，Czechoslovakia，2008，152(1)：35-39.

[12] Zhang H H，Wu Y，Sun Z L，et al.Identification of sanguinarine metabolites in pig liver preparations by accurate mass measurements using electrospray ionization hybrid ion trap/time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2013，27(9)：979-984.

[13] 卿志星，程辟，曾建國.博落回中生物堿質譜裂解規律研究進展[J].中草藥，2013，44(20)：2929-2939.

[14] 王珂佳，劉蕓.藥用植物博落回研究進展[J].河南農業，2015(14)：62-64.

[15] 劉金鳳，黃鵬，柳亦松，等.博落回屬植物內生真菌種類與分布差異[J].中國現代中藥，2016，18(7)：872-876.

[16] Vecera R.，Klejdus B，Kosina P，et al.Disposition of sanguinarine in the rat[J].Xenobiotica，2007，37(5)：549-558.

[17] Satpathi S，Gavvala K，Hazra P.Fluorescence switching of sanguinarine in micellar environments[J].Phys Chem Chem Phys，2015，17(32)：20725-20732.

[18] Miskolczy Z，Megyesi M，Tarkanyi G，et al.Inclusion complex formation of sanguinarine alkaloid with cucurbit[7]uril：inhibition of nucleophilic attack and photooxidation[J].Org Biomol Chem，2011，9(4)：1061-1070.

[19] 戎曉娟，韓陽，蔡曉翠，等.神香草水提取物在模擬胃腸道環境中的穩定性[J].藥物分析雜志，2015，35(3)：454-459.

[20] 何小解，盧向陽，易著文，等.模擬人體胃腸道環境對兒茶素穩定性的影響[J].湖南農業大學學報(自然科學版)，2005，31(5)：69-71.

[21] 郭宇鴿，曾建國，談滿良，等.博落回葉與小果博落回葉中4種生物堿的含量比較[J].中南藥學，2011，9(11)：829-832.

[22] 高坤，孫進，何仲貴.口服藥物吸收中的生物藥劑學性質[J].沈陽藥科大學學報，2007，24(3)：186-192.

[23] 張建福，彭聿平，閆長棟.人體生理學[M].北京：高等教育出版社，2007：164-176.

[24] 任大喜，郭鸰，霍貴成.體外模擬法研究生物利用率的影響因素[J].食品科技，2007(3)：12-14.

[25] 鄭宓，俞昌喜.天然生物堿類藥物藥代動力學研究的進展[J].海峽藥學，2011，23(3)：8-11.

StabilityAnalysisofMajorAlkaloidsinMacleayacordataunderSimulatedGastrointestinalEnvironment

ZHANG Huancheng1,2，CHEN Mei1,2，LIU Yisong1，2，TANG Zhaoshan3，ZENG Jianguo1，2*，LIU Zhaoying1，2*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，
HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.NationalandProvincialUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.MicoltaBiologicalResourceINC，Changsha410005，China)

Objective：In order to explain the reasons of low bioavailability of four alkaloids (protopine，allocryptopine，sanguinarine，chelerythrine) inMacleayacordata，the study explored the stability of four alkaloids in the simulated gastrointestinal environment.MethodsA high performance liquid chromatography method was used to determine the stability of four alkaloids inM.cordataunder the environment of different pH media，artificial gastric juice (pH=1.3) and artificial intestinal juice (pH=6.8).ResultsThe recovery rate of protopine and allocryptopine were ranging from 97.16% to 101.89% in the environment of acidic，neutral，alkalinity media，artificial gastric juice and artificial intestinal juice for 8 h.The recovery rate of sanguinarine was 48.81%-60.53% in the environment of pH=6.8 phosphate buffer solution (PBS)，water，pH=7.8-8.0 PBS and artificial intestinal juice for 8 h.The recovery rate of chelerythrine was 81.21%-93.48% in the environment of pH=5.8 PBS，pH=6.8 PBS，water and artificial intestinal juice for 8 h，while in the environment of pH=7.8-8.0 PBS for 8 h，the recovery rate of chelerythrine was 57.43%.ConclusionThe stability of protopine and allocryptopine was not affected by pH.While along with the increase of pH，the stability of sanguinarine and chelerythrine was reduced.The stability of four alkaloids inM.cordataunder the simulated gastrointestinal environment accorded with the environment of different pH media.The results provide a scientific basis for clarifying the pharmacokinetic characteristics of Sangrovit.

Macleayacordata；sanguinarine；chelerythrine；gastrointestinal tract stability

湖南省科技重點計劃(2016SK3002)；湖南省自然科學基金(2017JJ1017)

*

曾建國，博士生導師，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用，Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn；劉兆穎，碩士生導師，副教授，研究方向：獸醫藥理學與毒理學，E-mail：liu_zhaoying@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.007

2017-02-22)