基于UHPLC-QTOF/MS的博落回花中生物堿類化學(xué)成分研究△

黃嘉璐，劉秀斌，鄭亞杰，鄒超蘭，2，唐昭山，曾建國，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·基礎(chǔ)研究·

基于UHPLC-QTOF/MS的博落回花中生物堿類化學(xué)成分研究△

黃嘉璐1，劉秀斌1，鄭亞杰1，鄒超蘭1，2，唐昭山3，曾建國1，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；
2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

目的利用高通量、高靈敏和快速的UHPLC-QTOF/MS技術(shù)開展博落回花中的微量生物堿類成分的定性研究，闡明博落回花中生物堿類化學(xué)成分的類別和種類，為博落回植物的安全性提供科學(xué)依據(jù)。方法采用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)，借助數(shù)據(jù)挖掘方法發(fā)現(xiàn)和識別出博落回花中的微量生物堿類化學(xué)成分，對其高分辨一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，完成對微量生物堿類化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)推測和確認(rèn)。結(jié)果從博落回花中共鑒定了22個(gè)生物堿類化合物，主要化學(xué)成分為普洛托品類生物堿(原阿片堿、別隱品堿)和四氫原小檗堿類生物堿(N-甲基刺罌粟堿、N-甲基四氫小檗堿)。結(jié)論該研究結(jié)果為博落回植物的更全面、客觀的品質(zhì)評價(jià)和安全性評價(jià)提供了充分的科學(xué)依據(jù)。

博落回花；生物堿；UHPLC-QTOF/MS；定性分析

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.為罌粟科博落回屬多年生草本植物，全草皆可入藥，但有一定毒性[1-3]。博落回主要分布在我國長江以南、南嶺以北的山坡、路邊及溝邊，花期為6—7月[4]。博落回作為有毒蜜源植物[5-7]，國內(nèi)文獻(xiàn)中報(bào)道的多起食用蜂蜜中毒事件，因在有毒蜂蜜中發(fā)現(xiàn)博落回花粉，懷疑博落回是蜂蜜中毒性成分的來源[8-10]。本研究團(tuán)隊(duì)基于前期對博落回植物化學(xué)成分的安全性評價(jià)研究[11]，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，認(rèn)為食用蜂蜜導(dǎo)致中毒的根本原因與博落回沒有關(guān)系。對于博落回在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 14963-2011)中明確被禁止作為蜜源植物的規(guī)定，作者認(rèn)為可商榷分類且不納入危險(xiǎn)級別。博落回中生物堿類成分被認(rèn)為是主要的毒性成分，然而迄今僅有博落回果莢、莖、葉和根中化學(xué)成分及其毒性的研究報(bào)道[14-17]，博落回花中化學(xué)成分的類別和含量還尚未見報(bào)道。

UHPLC-QTOF/MS技術(shù)因具有分析速度快、靈敏度高和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在中藥材等復(fù)雜樣品中微量或痕量成分分析方面具有顯著的優(yōu)勢。本研究利用UHPLC-QTOF/MS開展博落回花中生物堿類化學(xué)成分的定性分析研究，為闡明博落回花中生物堿類等化學(xué)成分，以及博落回植物的品質(zhì)評價(jià)和安全性評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀-6530四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UHPLC-QTOF MS，美國Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理軟件為Masshunter；METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器)；MI-Q超純水機(jī)(貝徠美生物公司)；0.22 μm有機(jī)相/水相通用針式濾器及液相樣品瓶(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；無菌注射器(圣光醫(yī)用制品)；50 mL離心管(CORNING CentriStar公司)。

1.2 試藥與試劑

博落回花采自國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾建國教授鑒定為博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.的花。甲醇(色譜純，美國Merck)；甲酸(色譜純，美國TEDIA)；水為Milli-Q超純水；生物堿對照品來源詳見表1。

表1 生物堿對照品來源信息

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：華譜XAqua C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫見表2；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；檢測波長：287 nm。

表2 梯度洗脫色譜條件

質(zhì)譜條件：掃描模式：ESI+全掃描模式；毛細(xì)管電壓：3500 V；干燥氣溫度：345 ℃；干燥氣體積流量：10 L·min-1；脫溶劑溫度：350 ℃；掃描范圍m/z：100～1200 Da；二級裂解電壓：20～45 eV。參比溶液中含嘌呤(C5H4N4，m/z：121.050 873)和HP-0921(C18H18O6N3P3F24，m/z：922.009 798)。

2.2 樣品預(yù)處理

于6月上旬摘取新鮮博落回花，立即放入液氮中冷卻，用液氮磨成粉狀后進(jìn)行供試溶液制備。

2.3 供試品溶液的制備

稱取液氮研磨成粉狀的博落回花約1.0 g，置于具塞玻璃錐形瓶中，加入甲醇25 mL，30 ℃超聲30 min，靜置后取上清液6500 r·min-1離心10 min，繼續(xù)取上清液過0.22 μm有機(jī)相膜于液相小瓶內(nèi)，備用。

2.4 對照品溶液的制備

取上述對照品各約5 mg，精密稱定，分別加入甲醇超聲溶解后定容至25 mL，吸取適量用甲醇稀釋制成約1 μg·mL-1的單標(biāo)溶液。

2.5 數(shù)據(jù)挖掘方法

供試品溶液按2.1項(xiàng)中LC-MS條件進(jìn)行分析檢測，利用Agilent MassHunter workstation Software(version B.05.00)軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理。將全掃描模式的一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MassHunter軟件中分子特征查找(Find by Molecular Feature，MFE)功能，對博落回花樣品中所含的未知化合物進(jìn)行查找。MFE參數(shù)設(shè)置：正離子形態(tài)為M+、[M+H]+或[M+Na]+；電荷數(shù)為1～2，化合物最低絕對峰高為3000 counts；保留時(shí)間范圍設(shè)定為3～27 min；化合物同位素質(zhì)量偏差范圍為0.002 5 Da；目標(biāo)化合物類型為小分子有機(jī)化合物。

對疑似生物堿類成分的推測，在MFE查找出的化合物列表中，首先通過與隨行的空白樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，去除干擾信息。接著與文獻(xiàn)報(bào)道的以及課題組前期整理的博落回生物堿類成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的精確分子量、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，對可能的生物堿類成分進(jìn)行初步確認(rèn)。最后對可能的生物堿類成分通過與其對應(yīng)的對照品進(jìn)行LC-MS/MS確認(rèn)，對它們的M+或[M+H]+的精確分子量(m/z)、保留時(shí)間和MS/MS譜進(jìn)行對比分析，若查找化合物的m/z及保留時(shí)間與生物堿對照品的偏差分別在0.001 0 Da和0.15 min內(nèi)，則可初步確定該化合物與生物堿對照品為同一化合物，MS/MS譜可進(jìn)一步提高化合物推測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)果與分析

3.1 分析條件的建立

在本課題組前期工作基礎(chǔ)上[18]，本研究對色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，保證色譜圖上色譜峰具有好的峰形和分離。如圖1所示，在總離子流中各色譜峰分離度適中，主要色譜峰均達(dá)到基線分離，色譜峰信號響應(yīng)良好。

3.2 數(shù)據(jù)挖掘

對UHPLC-QTOF/MS采集的博落回花的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MFE進(jìn)行化合物查找，共發(fā)現(xiàn)了331個(gè)化合物信號。將發(fā)現(xiàn)的這些化合物信號，與空白樣品和對照樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，剔除了來自溶劑等背景干擾信號；結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[19]及課題組前期整理的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的生物堿類化合物的M+、[M+H]+及[M+Na]+等精確質(zhì)量數(shù)，對樣品的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行提取離子操作，共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)可能的生物堿類化學(xué)成分，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表3。

3.3 生物堿類成分推測結(jié)果的確認(rèn)

通過購買或?qū)嶒?yàn)室合成獲取了上述推測的22個(gè)生物堿類化合物的對照品或純品。通過UHPLC-QTOF MS/MS對樣品中發(fā)現(xiàn)的可能生物堿類化合物與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或純品進(jìn)行比較分析，重點(diǎn)比較提取離子色譜峰的保留時(shí)間、一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜中產(chǎn)物離子的質(zhì)量數(shù)和豐度等信息(見圖2)的一致性。結(jié)果，上述推測的22個(gè)生物堿類化合物信息與對照品或純品相一致(見表3)，表明本研究所推測的結(jié)果是準(zhǔn)確的和可靠的。

圖1 博落回花UHPLC-QTOF MS總離子流圖

圖2 化合物9提取離子色譜圖及相關(guān)質(zhì)譜圖

色譜峰編號tR/min[M+H]+/M+(m/z)質(zhì)量偏差元素組成MS/MS[m/z，豐度(%)]化合物名稱145422721278-1102C16H17NO3123(628)，161(725)，143(986)，115(1255)，107(10000)去甲基衡州烏藥堿252773161526-7908C18H21NO4137(1945)，175(2076)，143(4526)，192(5814)，123(10000)3?羥基?N?甲基衡州烏藥堿358282861437-0699C17H19NO3209(689)，194(711)，143(1066)，115(1044)，107(10000)衡州烏藥堿4602930015970999C18H21NO3237(969)，209(1014)，175(1047)，143(1251)，107(10000)(S)?N?甲基衡州烏藥堿566223301699-0303C19H23NO4177(1866)，175(2129)，143(3573)，137(6543)，192(10000)網(wǎng)脈荔枝堿6731532815460914C19H21NO491(358)，119(364)，151(1045)，163(1256)，178(10000)金黃紫堇堿7796632613890613C19H19NO4155(1501)，171(1616)，151(2432)，170(4674)，178(10000)碎葉紫堇堿8851734217030877C20H23NO4176(243)，165(253)，151(656)，163(1208)，178(10000)四氫非洲防己堿9929435413431977C20H19NO5206(1760)，275(2172)，149(3798)，188(9366)，189(10000)原阿片堿

表3(續(xù))

在假定所有生物堿類化合物的質(zhì)譜信號響應(yīng)一致的前提下，對發(fā)現(xiàn)的22個(gè)化合物的提取離子色譜圖進(jìn)行比較分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)博落回花中所含的生物堿類次生代謝產(chǎn)物主要有原阿片堿(9)、別隱品堿(10)、(s)-cis-N-甲基刺罌粟堿(12)和(s)-cis-N-甲基四氫小檗堿(14)等。

4 討論

博落回中主要含有生物堿、黃酮、三萜等類次生代謝產(chǎn)物[14，20-21]，其中生物堿類成分既是有效活性成分也是毒性成分[22-24]。博落回安全性研究發(fā)現(xiàn)，博落回總堿的小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗(yàn)LD50值為1657 mg·kg-1[12]；博落回生物堿硫酸鹽是博落回果莢提取物精制而成的，主要含有血根堿和白屈菜紅堿，該藥品通過小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗(yàn)的LD50值，水溶液為900 mg·kg-1，水混懸液為1043 mg·kg-1[13]；博落回提取物PE50(主要含有原阿片堿和別隱品堿)的小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗(yàn)LD50值為426.1 mg·kg-1，屬中等毒性[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)博落回花中主要含有原阿片堿和別隱品堿等普洛托品類生物堿，以及四氫原小檗堿類生物堿(N-甲基刺罌粟堿、N-甲基四氫小檗堿)。由于該類生物堿具有一定的毒性，按有毒蜜源植物標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)在博落回花期采取相應(yīng)措施以達(dá)到減少蜜蜂采集該植物花蜜的目的。但該類生物堿毒性與相關(guān)植物如雷公藤、鉤吻相比較低得多，因此建議考慮對有毒蜜源標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行危險(xiǎn)分級，以免誤導(dǎo)毒源的判定。在蜜蜂采集博落回花蜜后，經(jīng)過自身生物作用和貯存期間的物理或化學(xué)變化，需要進(jìn)一步對殘留在蜂蜜中的生物堿含量進(jìn)行定量分析，繼而才能精準(zhǔn)地對博落回作為有毒蜜源植物做出更為客觀的毒性評價(jià)。博落回植物為全草入藥，對其花中化學(xué)成分的闡明，可為該植物的全面品質(zhì)評價(jià)提供很好的參考依據(jù)。

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IdentificationofAlkaloidsinFlowersofMacleayacordata(Willd)R.Br.byUHPLC-QTOF/MS

HUANG Jialu1，LIU Xiubin1，ZHENG Yajie1，ZOU Chaolan1，2，TANG Zhaoshan3，ZENG Jianguo1，2 *

(1.Horticulture&LandscapeCollegeofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.CollegeofPharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；3.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Objective：To elucidate the minor alkaloids in the flower ofMacleayacordatabyusing the ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS) for safety evaluation ofM.cordata.MethodsThe alkaloids were found and identified through the serious data mining，structural speculation on basis of the careful analysis of the MS and MS/MS data，and confirmed by comparison with the reference standards and library.ResultsThere were total 22 alkaloids found in the flower ofM.cordataincluding protopines and tetrahydroprotonerberines，the main alkaloids including protopine，allocryptopine，N-methyltetrahydroberberine，N-methyltetrahydropapaverine.ConclusionThe results provide sufficient scientific evidence for evaluating its quality and safety of the flowers fromM.cordatacomprehensively and objectively.

Flowers ofMacleayacordata；alkaloid；UHPLC-QTOF/MS；qualitative analysis

國家自然科學(xué)基金(31600238)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16C0769)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2014B302)；湖南省科技重點(diǎn)計(jì)劃(2016SK3002)

*

曾建國，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.005

2017-02-20)