基于ITS2序列的博落回屬植物鑒定研究△

黃鵬，劉金鳳，徐敏，夏麗瓊，柳亦松，3，唐其，唐昭山，曾建國(guó)*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

·基礎(chǔ)研究·

基于ITS2序列的博落回屬植物鑒定研究△

黃鵬1，劉金鳳1，徐敏1，夏麗瓊2，柳亦松1，3，唐其1，唐昭山4，曾建國(guó)1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

目的采用ITS2序列對(duì)博落回屬藥用植物進(jìn)行鑒定。方法通過(guò)對(duì)來(lái)自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶的30個(gè)博落回屬植物ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增效率及測(cè)序成功率、堿基構(gòu)成、種內(nèi)和種間變異分析及NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析來(lái)評(píng)估ITS2序列鑒定效果。結(jié)果博落回屬藥用植物ITS2序列長(zhǎng)度在500 bp以?xún)?nèi)，擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率為100%，并獲得30條博落回ITS2序列。結(jié)論ITS2序列可以有效準(zhǔn)確鑒別博落回屬植物。

博落回屬；ITS2序列；DNA條形碼；物種鑒定；遺傳分化

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.與小果博落回M.microcarpa(Maxim.)Fedde.屬于罌粟科博落回屬植物?，F(xiàn)代藥理研究表明博落回屬植物中的4種主要生物堿：原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿對(duì)治療多種炎癥有效，并對(duì)畜禽類(lèi)有較好的腸道菌群調(diào)節(jié)作用，目前已作為飼用抗菌藥的替代品在歐洲等地區(qū)銷(xiāo)售[1]。博落回與小果博落回主要分布于中國(guó)、東亞、北美洲和歐洲，兩者的形態(tài)區(qū)別主要是果莢部分，博落回的果莢呈倒卵形，而小果博落回的果莢呈近圓形。前期研究顯示博落回與小果博落回中的4種主要生物堿具有組織分布特異性，其中血根堿和白屈菜紅堿主要分布在博落回的果莢和小果博落回的葉片中，而原阿片堿和別隱品堿主要分布在博落回葉片、根和小果博落回果莢中[2]。由于在博落回屬植物中一般只有博落回的果莢才是用來(lái)提取血根堿的原料，因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法區(qū)分博落回與小果博落回具有重要的意義。

DNA條形碼技術(shù)是一種基于DNA分子進(jìn)化原理，通過(guò)一段通用的標(biāo)準(zhǔn)短序列對(duì)物種進(jìn)行鑒定的新生物學(xué)技術(shù)[3]。近年來(lái)，DNA條形碼作為物種鑒定的工具已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的物種鑒定及種間親緣關(guān)系的分析，在眾多的DNA條形碼中，ITS2序列具有序列片段較短、進(jìn)化速率較快等特點(diǎn)，已經(jīng)成功運(yùn)用于許多傳統(tǒng)中藥材的鑒定[4-9]。這些研究均證明ITS2特征序列在中藥材的鑒定方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[10]。雖然應(yīng)用ITS2條形碼特征序列鑒別物種的研究越來(lái)越多，但是系統(tǒng)地用于博落回屬植物鑒別的報(bào)道很少。因此，利用ITS2序列片段建立一種準(zhǔn)確鑒定博落回屬植物的分子鑒定體系，不僅可以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)，而且對(duì)用藥安全具有十分重要的意義。本研究對(duì)博落回屬植物ITS2序列進(jìn)行比較分析和快速準(zhǔn)確鑒定，旨在為博落回屬植物分子鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料

共收集30份博落回屬植物根部材料，采自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶等地，均用網(wǎng)袋及泥土包裹根部材料運(yùn)送至湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心。在種植1年后待長(zhǎng)出地上部分再采集葉片進(jìn)行DNA提取，具體樣本信息見(jiàn)表1。

表1 博落回屬植物樣本信息

2 方法

2.1 DNA提取和序列擴(kuò)增

博落回與小果博落回新鮮葉片用超純水洗凈之后，用滅菌濾紙吸凈表面水分。加入適量液氮充分研磨成粉末；再用取樣小勺稱(chēng)取200～300 mg粉末樣本置1.5 mL離心管中，使用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA(TIANGEN#DP342-01)。在凝膠成像儀下觀察拍照并篩選出提取效果較好的樣品用于下一步的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)包含：ddH2O 12 μL、2 Taq mastermix 10 μL、DNA模板1 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL。本實(shí)驗(yàn)參照遠(yuǎn)志屬研究結(jié)果[11]，引物正向?yàn)椋篈TGCGATACTTGGTGTGAAT，反向?yàn)椋篏ACGC-TTCTCCAGACTACAAT。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min，再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸7 min。

2.2 電泳檢測(cè)

稱(chēng)取0.5 g瓊脂糖凝膠于錐形瓶中，加入50 mL 50×TAE緩沖液，中高火微波2 min，將錐形瓶置于水中5 min，加入0.5 μL GelRed，混勻后倒于凝膠模具中20 min后使用。取PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳，100 V，23 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)凝膠拍照，得到結(jié)果。

2.3 數(shù)據(jù)處理

選擇PCR擴(kuò)增成功的DNA樣品交由擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)后應(yīng)用Clustal W軟件對(duì)所有ITS2序列對(duì)位排列，并用Geneious 10.0.2對(duì)校對(duì)后的序列進(jìn)行分子進(jìn)化遺傳分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增

對(duì)30份博落回樣品的ITS2序列分析發(fā)現(xiàn)，所有實(shí)驗(yàn)樣本的PCR擴(kuò)增及測(cè)序成功率均為100%，序列獲得率(有效序列比例)亦為100%，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴(kuò)增電泳圖(見(jiàn)圖1)，擴(kuò)增效果較好，條帶較亮，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，產(chǎn)物大小在500 bp以?xún)?nèi)。

注：泳道上序號(hào)對(duì)應(yīng)樣本序號(hào)。圖1 30份博落回樣本的ITS2序列凝膠電泳圖

3.2 測(cè)序及序列分析

博落回屬的30份樣本ITS2序列的PCR及測(cè)序成功率均為100%。ITS2序列博落回種內(nèi)遺傳距離為0.001 4～0.009 4，平均值為0.003 2。種間的遺傳距離為0.077 2～0.084 8，平均值為0.079 3。表明其種間遺傳距離要明顯大于種內(nèi)遺傳距離。

3.3 堿基構(gòu)成分析

由表2可知，博落回屬植物ITS2序列中A、C、G、T堿基的變化范圍分別為1.27%、2.17%、0.9%、2.99%。其中，湖南株洲縣產(chǎn)地的博落回A堿基含量最高，為21.3%；江西瑞昌縣產(chǎn)地的博落回A堿基含量最低，為16.7%。河南嵩縣產(chǎn)地的小果博落回C堿基含量最高，為33.9%。浙江臨安縣產(chǎn)地的博落回C堿基含量最低，為28.9%。浙江臨安縣產(chǎn)地的博落回以及重慶巫山、湖北襄陽(yáng)市南漳縣、陜西商洛市產(chǎn)地的小果博落回G堿基含量最高，為32.6%；湖南株洲縣產(chǎn)地的博落回G堿基含量最低，為29.4%。江西瑞昌縣產(chǎn)地的博落回T堿基含量最高，為21.9%。湖北襄陽(yáng)市南漳縣小果博落回T堿基含量最低，為14.7%。

表2 博落回屬植物ITS2序列堿基構(gòu)成

3.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

利用Geneious10.0.2軟件，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖2)。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性用1000次重復(fù)的自展檢驗(yàn)(Bootstrap analysis)來(lái)評(píng)估，分支的支持值低于50%的略去。結(jié)果顯示博落回分為一支，小果博落回被分為另一支。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(shù)

4 討論

近年來(lái)，隨著DNA條形碼技術(shù)的不斷發(fā)展及應(yīng)用，越來(lái)越多的藥用植物都使用該技術(shù)進(jìn)行物種鑒定，如野豌豆屬[11]、遠(yuǎn)志屬[12]、千斤拔屬[13]和黃芩屬[14]等大量的藥用植物均已成功使用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定。陳士林等[10]認(rèn)為應(yīng)當(dāng)建立以ITS2為核心、psbA-trnH為輔的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系，這為中藥材準(zhǔn)確、可靠鑒定及臨床用藥安全提供新的技術(shù)手段。

本課題組已于2012年完成了博落回屬植物的轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序[1]，對(duì)不同時(shí)間的根葉果材料的轉(zhuǎn)錄組以及生物堿生源合成可能的機(jī)理進(jìn)行了探索，之后又對(duì)博落回進(jìn)行了全基因組測(cè)序，為下一步的功能基因挖掘和分子育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。由于博落回是目前最主要的血根堿來(lái)源植物，在博落回屬植物中只有博落回的果莢才是用來(lái)提取血根堿的原料。而分辨博落回與小果博落回的主要區(qū)別也是果莢部位，因此在博落回屬植物生長(zhǎng)早期區(qū)分兩者困難較大。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ITS2序列鑒定博落回屬植物，結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)樣本的PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率均達(dá)到100%，表明ITS2序列適合于博落回屬植物的鑒定且穩(wěn)定性較好。除了運(yùn)用ITS2序列以外，本實(shí)驗(yàn)樣本涵蓋了湖南、江西、浙江、湖北、河南、陜西、重慶等多個(gè)產(chǎn)地，鑒定結(jié)果表明不同產(chǎn)地的博落回屬植物種內(nèi)差異較小，說(shuō)明博落回屬植物遺傳多樣性較低并且符合本實(shí)驗(yàn)室之前的SSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]。從最終數(shù)據(jù)分析，ITS2條形碼序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)顯示ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒別博落回與小果博落回，保證了原料收集的準(zhǔn)確性。

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IdentificationofPlantsinMacleayaspp.BasedonITS2Sequence

HUANG Peng1，LIU Jinfeng1，XU min1，XIA liqiong2，LIU Yisong1，3，TANG Qi1，TANG Zhaoshan4，ZENG Jianguo1*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，
HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.Schoolofpharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；3.VeterinaryFacultyofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；4.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Objective：To identify the medicinal plantMacleayaspp.by using ITS2 sequence.MethodsThe ITS2 sequence and sequence of 30 samples collected from Hunan，Jiangxi，Zhejiang，Hubei，Henan，Shanxi，Chongqing was amplified and the amplification efficiency，the sequencing success rate，the constitution of base pair，intra- and inter-specific variation and NJ(Neighbor-Joining) tree were analyzed，in order to evaluate the ITS2 sequencing results.ResultsThe ITS2 sequence length ofMacleayaspp.was within 500 bp；the amplification efficiency and the success sequencing rate was 100% and 30 ITS2 sequences were obtained.ConclusionThe ITS2 sequence can be effective and accurate for identification ofMacleayaspp..

Macleayaspp.；ITS2 sequence；DNA barcode；Species identification；Genetic differentiation

國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開(kāi)放項(xiàng)目(15KFXM09)；湖南省科技重點(diǎn)計(jì)劃(2016SK3002)

*

曾建國(guó)，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.003

2017-02-20)