中藥清濁湯對慢性非細菌性前列腺炎大鼠前列腺組織形態及COX-2、NF-κB表達的影響

尤傳靜 吳 強 張 浩

1. 南京中醫藥大學沭陽附屬醫院（江蘇沭陽 223600）；2. 六安市中醫院

中藥清濁湯對慢性非細菌性前列腺炎大鼠前列腺組織形態及COX-2、NF-κB表達的影響

尤傳靜1吳 強1張 浩2

1. 南京中醫藥大學沭陽附屬醫院（江蘇沭陽 223600）；2. 六安市中醫院

目的探討中藥清濁湯對慢性非細菌性前列腺炎大鼠前列腺組織形態及COX-2、NF-κB的影響，明確清濁湯治療慢性非細菌性前列腺炎的作用機制，為其治療該病提供理論支持。方法選取健康的雄性SD大鼠80只，60只造模采取多點皮下注射大鼠前列腺蛋白提純液和弗氏完全佐劑法建立慢性非細菌性前列腺炎模型，余20只為空白組。造模成功的60只大鼠按隨機數字表隨機分為模型組、陽性藥物組、清濁湯組各20只。陽性藥物組、清濁湯組連續給藥30d后處死，采集標本通過光鏡觀察各組大鼠前列腺組織形態學改變，免疫組化法并結合圖形圖像分析系統檢測前列腺組織COX-2、NF-κB表達的變化。結果清濁湯能明顯減輕慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠前列腺組織的炎癥反應。模型組大鼠COX-2水平為0.4030±0.0136，明顯高于正常組水平0.0878±0.0382（P＜0.01）；NF-κB水平為0.5330±0.0137，明顯高于正常組水平0.0698±0.0117（P＜0.01）；與模型組大鼠前列腺組織COX-2、NF-κB比較，治療各組水平為0.1570±0.0221及0.2001±0.0312均有所降低（P＜0.05）；與陽性藥物組前列腺組織COX-2水平0.3711±0.0457、NF-κB 水平 0.4003±0.0879比較，清濁湯組下降更顯著（P＜0.01）。結論清濁湯可改善慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠前列腺組織內環境，降低COX-2、NF-κB水平表達可能為其作用機制。

清濁湯; 大鼠; 前列腺炎

慢性非細菌性前列腺炎（chronic non-bacterial prostates, CNP）是男科的常見病，多發病，好發于中青年男性人群，臨床癥狀為尿頻、尿急、尿不盡、尿等待等排尿異常，部分合并會陰部、小腹部、恥骨區、腰骶部等酸脹不適癥狀，嚴重影響患者的生活質量[1]。有資料顯示50%的男性在其一生中可能曾有過前列腺炎的癥狀[2]，其中慢性非細菌性前列腺炎占絕大部分，具發展緩慢甚至時有消失、病情頑固不易徹底清除、病程纏綿反復的特點[3]。眾多研究表明，此病與前列腺局部免疫功能密切相關[4]。前列腺位置和解剖結構特殊，同時發病機制復雜，單純使用抗生素治療效果不佳。傳統中醫藥在治療該病方面表現優異，本研究探討我科協定方劑“清濁湯”對慢性非細菌性前列腺炎大鼠前列腺組織形態的影響，同時測定前列腺組織COX-2、NF-κB的水平變化，闡述其治療慢性非細菌性前列腺炎的部分作用機制。

材料與方法

一、實驗材料

（一）實驗動物

選取180～220g健康雄性SD大鼠80只，由安徽醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（皖）2015-002]。獨立送風隔離籠具飼養，大鼠自由飲水進食，每日日照時間約12h，室內通風良好，溫度保持在18～25℃，相對濕度為50%左右，適應性飼養1周無異常后進行實驗。

（二）實驗藥物

科室協定方劑清濁湯（桃仁、紅花、赤芍、丹參、土茯苓、萆薢、王不留行、蒼術、延胡索、川牛膝、皂角刺、紫花地?。?，由南京中醫藥大學沭陽附屬醫院提供。先將清濁湯生藥經蒸餾水浸泡約1h，按常規方法煎煮2次，每次約45min，將兩次藥水混合，過濾，干燥濃縮至1:1（含生藥1g/mL），置于4℃冰箱保存備用。前列舒通膠囊（保定步長天浩制藥有限公司提供，規格：0.4g，批號：20140202），將膠囊拆解溶于蒸餾水配成混懸液（含生藥0.2g/mL）。

（三）主要實驗試劑與儀器

弗氏完全佐劑（America Sigma Company）；百白破疫苗（武漢生物）；COX-2免疫組化試劑盒（北京博奧森）；NF-KBP65免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（ZLI-9032）PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液（北京中杉）；酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Nikon80熒光顯微鏡（新飛達光學儀器公司）。

二、實驗方法

（一）大鼠前列腺蛋白提純液的制作

取250～300g雄性SD大鼠10只，處死后局部皮膚碘伏消毒，下腹部正中切口，分離出前列腺的背葉和腹葉，在嚴格無菌操作的條件下取出，將多余的組織剪除，用冷生理鹽水洗凈，加入含0.5%TritonX-100（內皮細胞損傷劑）等重的生理鹽水溶液，在冰水浴上用玻璃勻漿器制成組織勻漿液，將勻漿液置入10 000 r/min的高速離心機中，離心30min后取上清液[5]。

（二）測定蛋白含量

以牛血清白蛋白溶液為標準蛋白，用酶標儀進行組織蛋白含量的檢測。最后用0.1mol/L PBS緩沖液將其稀釋成15 mg/mL的濃度，放入4℃冰箱冷藏備用。

（三）動物分組和造模

在80只雄性SD大鼠中取60只造模，余20只為空白組。將造模的60只雄性SD大鼠分別在第1天和第30天腹腔注射百白破疫苗各0.5mL，同時將大鼠前列腺蛋白提純液（濃度為15g/L）和弗氏完全佐劑（FAC）按比例1:1配置成的混懸液，給予兩次多點皮內注射1.0mL/只[6]；45d后造模成功。造模成功后，隨機分為模型組、陽性藥物組和清濁湯組，各組20只大鼠。

（四）給藥方法

各組大鼠在注射前列腺蛋白提純液45d后開始灌胃給藥，空白組和模型組均予以生理鹽水1mL/100g灌胃，陽性藥物組按1.0g/kg灌胃，清濁湯組按0.92g/kg灌胃，每天一次，連續30d。

（五）動物取材

連續給藥30d，末次給藥24h后，大鼠麻醉后處死，無菌條件下摘取下前列腺，稱重后HE染色切片，光鏡下觀察前列腺組織形態，同時按照免疫組化試劑盒說明書測定組織COX-2、NF-κB水平變化。

（六）統計方法

結 果

一、光鏡下各組大鼠前列腺病理組織形態學改變

空白組：大鼠前列腺腺腔結構完整清晰，腺體形態排列正常，腺體無明顯擴張，腺腔內通暢，無炎性細胞浸潤或水腫。模型組：大鼠前列腺結構呈明顯異常，腺上皮萎縮、脫落或增生，部分基底膜被破壞，分泌物增多或減少，間質水腫明顯，大量炎性細胞浸潤，多為淋巴細胞。清濁湯組大鼠前列腺組織結構比較完整，前列腺上皮呈立方或柱狀，無破壞及萎縮，少數切片可見前列腺上皮輕度增生和輕微的充血，間質無明顯的炎癥細胞浸潤或水腫。陽性藥物組有明顯的前列腺腺管萎縮或組織增生，伴有少量炎性細胞浸潤以及部分腺管破壞，見圖1。

二、大鼠前列腺組織環氧合酶-2的表達

各組切片經免疫組化染色可見，空白組大鼠前列腺組織內COX-2呈陰性表達；模型組上皮細胞胞漿內COX-2呈強陽性表達為棕褐色，間質內的炎癥細胞胞漿也有陽性表達，亦呈棕褐色；其他各組前列腺間質呈棕黃色表達，但與模型組相比表達明顯偏弱。用圖像分析系統對免疫組織化學結果進行平均光密度分析（見表1）：與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織COX-2表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，清濁湯組和陽性對照組均可降低COX-2的表達，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），但清濁湯組效果更優，見圖2。

三、大鼠前列腺組織核轉錄因子κB的表達

各組切片經免疫組化染色，空白組大鼠前列腺組織內NF-κB呈陰性表達；模型組上皮細胞胞漿內NF-κB 呈強陽性表達，呈明顯棕褐色，其間質內的炎癥細胞也有陽性表達，亦呈明顯棕褐色；其他各組前列腺間質呈棕黃色表達，但與模型組相比表達較弱。用圖像分析系統對免疫組織化學結果進行平均光密度分析（表2）。模型組大鼠前列腺組織NF-κB表達顯著增高，與各組相比有統計學意義（P＜0.01）；清濁湯組和陽性藥物組均可降低NF-κB的表達，但清濁湯組效果更加明顯（P＜0.01），見圖3。

圖1 各組前列腺組織病理學改變

圖2 各組前列腺組織COX-2免疫組化表達

表1 大鼠前列腺組織COX-2的表達（±s）

表1 大鼠前列腺組織COX-2的表達（±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性對照組比較，★P＜0.01

組別 n 平均光密度清濁湯組 20 0.1570±0.0221▲△★陽性對照組 20 0.3711±0.0457▲△空白組 20 0.0878±0.0382△模型組 20 0.4030±0.0136▲

表2 大鼠前列腺組織NF-κB的表達（±s）

表2 大鼠前列腺組織NF-κB的表達（±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥物組比較，★P＜0.01

組別 n 平均光密度清濁湯組 20 0.2001±0.0312▲△★陽性對照組 20 0.4003±0.0879▲△空白組 20 0.0698±0.0117△模型組 20 0.5330±0.0137▲

圖3 各組前列腺組織NF-κB免疫組化表達

討 論

傳統中醫古籍并無前列腺炎這一病名的相關記載，據其具體臨床癥狀，應屬于“淋、濁、精病”三大范疇，有大量的、詳細的類似前列腺炎的相關記載和描述[7,8]。首見于《證治匯補》記載：“精濁者，因敗精流于尿竅，滯而難出，故莖中如刀割火灼而尿自清，惟竅端時有穢物，如膿瘡且穢，淋漓不斷，與便溺決不相混”。指出精濁乃因敗精滯于尿竅而致。中醫認為基本病機為感受外邪，流注下焦，氣機阻滯；或因嗜食膏粱厚味，致使脾胃運化失常，清濁不分濕熱內生；或因情志失調，思欲過度，肝失疏泄與調達，氣機不暢，精道瘀阻；或因稟賦不足、房事、勞累過度，腎虧于下，精關不固?？傊?，邪實是發病的外在條件，正虛是發病的根本原因。清濁湯為我科治療慢性前列腺炎的協定方劑，前期已應用于臨床，療效顯著[9,10]，本方中重用桃仁活血祛瘀之功，《本經》記載：“瘀血血閉，癥瘕邪氣，殺小蟲?！眱群?種蛋白質成分PR-A和PR-B，有強的抗炎鎮痛藥理活性。紅花則散瘀止痛之力卓越，主要成分紅花黃色素有明顯增強巴比妥及水合氯醛的中樞抑制作用，兩藥合用為君藥，對于濕熱瘀阻導致的各種疼痛不適有奇效。赤芍具有清熱涼血解毒之功，又兼活血祛瘀止痛之效，現代藥理研究發現，它可以降低COX-2在滑膜內的表達，減少IL-1、IL-6和PGE2在滑膜細胞中的產生。丹參功擅活血祛瘀，又可清熱除煩及涼血消癰，兩藥共為臣藥。土茯苓主功解毒，除濕熱之邪。萆薢則利下焦濕熱，去穢濁之邪，祛風邪除痹痛，用于膏淋，白濁?，F代藥理學研究表明，土茯苓具有一定的抗炎和止痛作用。王不留行活血通經，利尿通淋。蒼術主功燥濕，具有一定的抑制細菌生長的功效，延胡索則可行氣止痛、活血散瘀，現代研究發現主要成分總生物堿有良好的止痛作用，川牛膝既可逐瘀通經，又可利尿通淋，又兼引藥下行之效。皂角刺和紫花地丁均可清熱解毒，涼血消腫，清熱利濕，有消毒，消炎，清熱的功效。此方具清熱祛濕、活血祛瘀、行氣止痛之功效，藥力可完全發揮直達病所。

慢性非細菌性前列腺炎性疼痛的產生和維持與炎性介質關系密切，其表達的變化對了解該病的發展與轉歸有重要的意義[11]。COX-2與前列腺炎疼痛癥狀的產生密切相關，COX-2是催化花生四烯酸生成前列腺素的一個重要的限速酶，參與了機體許多生理和病理過程。COX-2在炎癥反應中表達水平明顯增高，促進炎癥相關的前列腺素的合成，參與疼痛、腫脹、發熱等炎癥反應[12]。前列腺中存在活動的炎癥反應，高水平的細胞因子促進COX-2的表達，導致前列腺內COX-2增高，最終誘導前列腺素，尤其是PGE2的合成和聚積，導致疼痛等不適癥狀的發生。國外學者同樣認為，雖然引起慢性前列腺炎的病因不同，但最終都通過COX-2 路徑引起疼痛[13,14]，甚至誘發癌變[15]。轉錄因子NF-κB存在于各種細胞中，是多種信號轉導的鏈接點。它是一種普遍存在的誘導型核轉錄因子，靜息狀態下呈無活性狀態，當外源性刺激可通過一系列信號轉導從而導致其活化，借助于被暴露出來的核定位信號進入細胞核，在核內與靶基因的特異序列結合并啟動轉錄發揮其調控作用，從而啟動和調控一系列參與炎癥反應的因子表達[16,17]。相關研究已證實慢性前列腺炎患者前列腺液及精漿TNF-α等細胞因子水平偏高，而NF-κB可通過調節TNF-α的表達從而在炎癥反應中起關鍵的作用。研究證實TNF-α、IL-1、IL-6等多種炎癥介質的基因調控區均具有NF-κB的結合位點,且在多種炎癥介質的表達調控中均具有重要作用,是NF-κB的靶基因，并發現NF-κB與IL-1β、IL-6和TNF-α呈正相關，降低NF-κB活性即可降低細胞因子水平[18]。

通過本研究發現，模型組大鼠的COX-2、NF-κB水平明顯升高，說明它們與前列腺炎發病密切相關，其臨床表現多為濕熱瘀阻。我科中藥清濁湯具有清熱祛濕、活血祛瘀、行氣止痛功效，我科已應用于臨床治療，療效顯著[9,10]，本研究結果顯示該方能明顯減輕慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠前列腺組織的炎癥反應，改善前列腺組織結構的破壞，減輕大鼠前列腺組織的炎細胞浸潤、間質纖維化等改變；同時可以降低模型組大鼠前列腺組織中COX-2水平表達，效果明顯優于陽性對照組。通過調節NF-κB的水平，進而降低TNF-α的水平，抑制COX-2的表達，通過相關機制緩解前列腺相關癥狀。但由于時間限制，未能開展大樣本、多靶點的臨床實驗，其作用機制有待進一步深入研究。本研究為傳統中藥治療慢性非細菌性前列腺炎提供了部分理論支持。

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2 Krieger JN, Riley DE, Cheah PY, et al. Epidemiology of prostatitis:new evidence for a world-wide problem. World J Urol 2003; 21(2):70-74

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4 劉洪章, 馬志偉, 劉毅, 等. 醒腦靜注射液對急性腦損傷患者MDA, SOD, TNF-α, IL-8的影響. 中國實驗方劑學雜志 2011; 17(13): 225-226

5 尹躍兵, 陳波, 徐瑩, 等. 前列清濁湯對慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型血清TNF-α、IFN-y的影響. 湖南中醫雜志 2014; 30(1): 115-117

6 胡丙成, 徐鶯鶯, 張靜, 等. 參花雷火灸法對慢性非細菌性前列腺炎大鼠前列腺組織病理形態及IL-1β、TNF-α的影響. 針灸臨床雜志 2014; 30(10): 77-79

7 潘俊杰, 李結實, 金星. 慢性前列腺炎的辨證分型與治療觀察. 四川中醫 2011; 29(11): 57-59

8 金保方, 孫大林, 張新東. 對慢性前列腺炎診治的再認識與中醫藥的選擇. 環球中醫藥 2012; 5(7): 497-498

9 尤傳靜, 吳強, 王學永. 自擬清濁湯聯合微波治療IIIB型前列腺炎多中心療效微探. 江西中醫藥 2017; 48(409):28-30

10 尤傳靜,吳強.中藥清濁湯對IIIB型前列腺炎濕熱瘀阻癥患者SIgA、IL-8、TNF-α的影響. 中國男科學雜志2017; 31(2): 47-50

11 徐華明, 方曉艷, 劉延鑫. 肝舒樂片對慢性非細菌性前列腺大鼠前列腺組織的影響. 中醫學報 2014; 29(193):756-758

12 劉迎嘉, 張晨, 宋國宏. COX2在慢性前列腺炎導致大鼠神經痛中變化的實驗研究. 中國男科學雜志 2012;26(7): 8-10

13 Hirata A, Murakami Y, Shoji M, et al. Kinetics of radicalscavenging activity of hesperetin and hesperidin and their inhibitory activity on COX-2 expression. Anticancer Res 2005; 25(5): 3367-3374

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15 黃曉斌, 劉羅根, 王毅. COX2與前列腺癌的最新進展.西南軍醫 2017; 19(2): 151-153

16 安立文, 魏學智. 核轉錄因子NF-κB在慢性前列腺炎中的作用. 中國男科學雜志 2011; 25(2): 71-72

17 安立文, 魏學智. 核轉錄因子在慢性前列腺炎中的作用.黑龍江醫學 2011; 35(1): 17-18

18 趙亮, 陳玉琴, 程邵龍, 等.姜黃素對免疫性前列腺炎大鼠腫瘤壞死因子-α、核因子-κB、環氧合酶-2表達的影像. 重慶醫科大學學報 2016; 41(9): 910-914

（2017-07-05收稿）

Effects of Qingzhuo decotion on the morphology of prostate tissue and their COX-2 and NF-κB levels in rat models with chronic nonbacterial prostatitis

You Chuanjing1, Wu Qiang1, Zhang Hao2
1. ShuYang TCM Hospital, Jiangsu Shuyang 223600, China; 2. LiuAn TCM Hospital

ObjectiveTo observe the effects of QingZhuo Decoction on the morphology of prostate tissue and their COX-2 and NF-κB levels in rat models with chronic nonbacterial prostatitis Rats.MethodsEighty healthy male SD rats were selected ,the remaining 20 were blank groups. Sixty rats to establish a model of Chronic prostatitis by Multi -point hypodermic injection with Rat prostatic protein puri fi cation and Freund's complete adjuvant. Sixty rats with chronic nonbacterial prostatitits were randomly divided into the model group (n=20) and the treatment group (n=20) and the control group (n=20).. Rats in the treatment group were treated with QingZhuo decotion，and rats in control group with Qianlieshutong capluse, both for 30 days as a treatment course. Pathological changes of prostate tissue and their COX-2, NF-κB levels were analyzed after 30 days. Results Pathological changes of prostatitis tissue were ameliorated in the treatment group signi fi cantly compared with that of other groups (P＜0.05). The expressions of COX-2 and NF-κB in the treatment group were significantly lower than that of the control group and the differences were statistically significant (P＜0.05).ConclusionQingZhuo decotion can signi fi cantly downregulated the expressions of COX-2 and NF-κB and has good curative effect by reducing Prostatitits tissue pathological changes.

QingZhuo Decoction; rats; prostatitis

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.05.002

R 697.33