維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥一家系臨床表型和基因突變分析及療效評價

利婧 孫毅明 歐俐羽 朱瑜齡 王倞 李歡 張成

維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥一家系臨床表型和基因突變分析及療效評價

利婧 孫毅明 歐俐羽 朱瑜齡 王倞 李歡 張成

目的探討維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥家系臨床特點、基因突變和維生素B12治療效果.方法采集一維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥家系共4名成員臨床資料,抽取外周靜脈血行血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析及基因檢測,評價維生素B12治療效果.結果家系中先證者12歲發(fā)病,以學習成績下降、性格改變?yōu)槭装l(fā)癥狀,病程中出現幻覺、雙下肢無力;先證者之弟主要表現為易怒、學習成績較差.經血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析,先證者及其弟血漿丙酰肉堿、丙酰肉堿/乙酰肉堿比值升高,尿液甲基丙二酸水平升高.基因檢測顯示,先證者及其弟均存在MMACHC基因復合雜合突變c.482G>A(p.Arg161Gln)和c.609G>A(p.Trp203X),其父攜帶MMACHC基因錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln),其母攜帶MMACHC基因無義突變c.609G>A(p.Trp203X).經維生素B12治療后均癥狀好轉.結論晚發(fā)型維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥系MMACHC基因復合雜合突變所致,維生素B12治療反應良好,早期診斷、及時治療對患者預后意義重大.

甲基丙二酸; 代謝缺陷,先天性; 維生素B12; 表型; 基因; 突變; 系譜

甲基丙二酸血癥(MMA)cblC型系MMACHC基因突變導致其編碼的cblC蛋白缺乏,使L?甲基丙二酸無法轉變?yōu)殓晁岫谘褐行罘e,是臨床最常見的維生素B12代謝障礙性疾病,呈常染色體隱性遺傳,發(fā)病率為1/10萬～1/6萬[1].根據發(fā)病年齡,可以分為早發(fā)型(1歲內發(fā)病)和晚發(fā)型甲基丙二酸血癥.迄今文獻報道僅約10%患者為晚發(fā)型甲基丙二酸血癥[2?3].維生素B12依賴型甲基丙二酸血癥臨床罕見,通常于兒童期、青少年期或成年期發(fā)病,主要表現為精神癥狀、意識障礙和神經系統癥狀等,經及時治療預后較好[4?5],屬可治性神經系統遺傳性疾病.本研究報道一晚發(fā)型甲基丙二酸血癥家系,總結其臨床表現、血液化學、基因檢測和維生素B12治療后轉歸,探討維生素B12治療MMAcblC型的作用機制,以期提高兒科和神經科醫(yī)師對甲基丙二酸血癥的認識.

對象與方法

一、研究對象

本研究MMAcblC型患者于中山大學附屬第一醫(yī)院神經科就診,其家系2代共4名成員(圖1),漢族,其中2例符合常染色體隱性遺傳特點.

先證者 女性,13歲,主因性格改變1年、雙下肢無力2個月,于2016年11月24日至我院神經科門診就診.患者1年前無明顯誘因出現易激惹、易哭鬧,學習成績下降,未予重視;2個月前出現雙下肢無力,勉強能夠獨立行走,上樓梯費力,無肢體麻木,雙上肢未見異常;1月余前出現幻覺,以幻視為主,逐漸進展至行走不能.1個月前曾至外院就診,診斷為"可疑線粒體腦肌病或腦炎",予靜脈注射免疫球蛋白(IVIg)和甲潑尼龍等治療(具體劑量不詳),癥狀無明顯好轉,為求進一步診斷與治療,遂至我院就診.患兒足月順產,單胎,生長發(fā)育和智力發(fā)育正常;父母身體健康,無相似臨床癥狀,否認近親婚配.門診體格檢查:身高和體重于同齡兒童正常范圍.神經系統檢查:高級智能和腦神經檢查未見異常,雙側小腿肌萎縮,雙下肢近端肌力3級、遠端4級,肌張力降低,雙上肢肌力5級,肌張力正常;雙下肢痛觸覺和關節(jié)位置覺減退,四肢腱反射未引出,雙下肢Babinski征陽性,腦膜刺激征陰性.實驗室檢查:血尿便常規(guī)、肝腎功能試驗、血液化學、免疫學指標、血氨、血清維生素B12均于正常值范圍,血清同型半胱氨酸(Hcy)165.30 μmol/L(5～20 μmol/L).影像學檢查:胸部X線未見明顯異常.頭部MRI顯示輕度腦萎縮,尤以白質顯著,雙側側腦室旁長T1、長T2信號,擴散加權成像(DWI)呈顳頂葉放射冠低信號,表觀擴散系數(ADC)升高(圖2).磁共振波譜(MRS)顯示,N?乙酰天冬氨酸(NAA)峰、肌酸(Cr)峰、膽堿(Cho)峰峰值降低(圖3).電生理學檢查:心電圖未見明顯異常.腦電圖顯示中度異常,以θ波為主要背景波.

患兒Ⅱ2 男性,10歲,先證者之弟,于2016年12月6日至我院神經科門診就診.患兒足月順產,單胎,18個月方可獨立行走和會說話,智力發(fā)育較同齡正常兒童差,目前讀小學,學習成績較差,易怒,未予重視.門診體格檢查:身高和體重于同齡兒童正常范圍.神經系統檢查:注意力和計算力較差,語言復述能力較差,腦神經檢查未見明顯異常;四肢肌力5級、肌張力正常,感覺系統未見異常,腱反射降低,病理反射未引出,腦膜刺激征陰性.實驗室檢查:血尿便常規(guī)、肝腎功能試驗均于正常值范圍,血氨 51 μmol/L(10～47 μmol/L),血清維生素B12于正常值范圍,血清同型半胱氨酸84.20 μmol/L.

圖1 MMAcblC型家系圖Figure 1 The pedigree of MMAcblC.

二、研究方法

1.血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析 采集先證者及其弟外周靜脈血各2 ml制備干血濾紙,API3200液質聯用儀(美國SCIEX公司)采用串聯質譜法行血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析.采集先證者及其弟尿液制備3張尿液濾紙片,7890/5975C氣相質譜聯用儀(美國Agilent公司)行尿液氣相色譜質譜分析,檢測尿液各種有機酸之間的比值.

2.目標區(qū)域捕獲測序與數據分析 經先證者父母同意,采集該家系4名成員外周靜脈血各2 ml,行甲基丙二酸血癥相關二代基因測序(NGS).(1)基因組DNA提取和基因組文庫制備:2 ml外周靜脈血置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,采用QIAmp DNA Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)提取基因組 DNA. 取 3 μ g DNA,以 Tris?乙 二 胺 四 乙 酸(EDTA)緩沖液稀釋至30 ng/μl,采用Covris?S220超聲儀(美國Covaris公司)將樣本DNA片段化為長度150 bp,采用標準DNA文庫構建試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)進行片段末端修復加"腺嘌呤"和產物純化,經聚合酶鏈反應(PCR)擴增后,采用Nanodrop 2000紫外分光光度計(美國Therom公司)進行DNA文庫定量.(2)目標區(qū)域捕獲測序:采用GenCap液相捕獲目標基因技術對已知的176種代謝性疾病相關基因進行探針捕獲,覆蓋每種基因的外顯子及其上下游內含子長度50 bp區(qū)域,生物素標記的探針與文庫DNA雜交,鏈霉素標記的磁珠共價結合生物素標記的探針,抓取目的基因,磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠,洗脫純化,富集目的基因,再采用NextSeq 500高通量測序儀(美國Illumina公司)進行雙端測序.(3)數據處理與分析:原始數據剔除接頭和低質量短序列(<40 bp),BWA軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)將預處理的數據與hg19人類基因組數據庫(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/)進行比對,GATK3.3.0軟件包(https://www.broadinstitute.org/gatk)校準并重新匹配至參考序列,單堿基突變采用GATK UnifiedGenotyper分析,單核苷酸多態(tài)性(SNP)和插入/缺失突變采用共識編碼序列數據庫(CCDS)、hg19人基因組數據庫、單核苷酸多態(tài)性數據庫信息進行注釋,確定候選變異位點,SIFT預測軟件(http://sift.jcvi.org)對變異位點進行生物信息學分析.

3.Sanger測序驗證 據基因變異位點設計上下游引物,由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成,上游引物序列:5'?CCTCCATGACCTTGCTTTTC?3',下游引物序列:5'?GGGATGCAGGTGGTGAGAC?3'.PCR反應體系共25 μl,反應條件為95℃ 10 min;94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 45 s,共3個循環(huán);94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 45 s,共5個循環(huán);94 ℃ 30 s、60℃ 30s、72℃ 45s,共 10 個循環(huán);94℃30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,共 17 個循環(huán);最終72℃ 5 min;4℃冷卻備用.然后采用ABI3130xl測序儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]將PCR擴增產物進行毛細管電泳,測序結果與標準參考序列(NM_001330540.1)進行比對.

結 果

一、臨床特征

該家系共2代4名成員,男性2名,女性2名;先證者12歲發(fā)病,主要表現為性格改變、學習成績下降,病程中出現幻覺、雙下肢無力癥狀,病程1年;先證者之弟自幼表現為易怒、智力低下,未明顯累及運動系統.

二、血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析

先證者血漿甲硫氨酸為7.80 μmol/L(8.50～50.00μmol/L),丙二酸0.60μmol/L(0～0.30μmol/L),丙酰肉堿(C3)6.39 μmol/L(0.30～5.00 μmol/L),丙酰肉堿/乙酰肉堿(C2)比值為0.41(0.02～0.25);尿液甲基丙二酸水平為 63.70 μmol/L(0～4 μmol/L).先證者之弟血漿丙酰肉堿5.29 μmol/L,C3/C2比值為 0.59,天冬氨酸為 62.60 μmol/L(18～47 μmol/L),精 氨 酸 95.50 μ mol/L(11～69 μ mol/L),丙 氨 酸576.70 μmol/L(210～545 μmol/L),谷氨酰胺水平為702 μmol/L(249～579 μmol/L);尿液甲基丙二酸為75 μmol/L.

圖2 頭部MRI檢查所見 2a 橫斷面T2WI顯示,輕度腦萎縮,尤以白質顯著(箭頭所示),雙側側腦室輕度擴大 2b 冠狀位FLAIR成像顯示,雙側側腦室旁異常高信號(箭頭所示)2c 橫斷面DWI顯示,雙側顳枕葉深部側腦室旁異常低信號(箭頭所示)2d 橫斷面ADC圖顯示病變呈高信號(箭頭所示) 圖3 頭部MRS顯示,左側側腦室旁NAA峰、Cr峰、Cho峰和NAA/(Cho+Cr)比值降低,考慮白質髓鞘化不良,提示代謝性疾病Figure2 Head MRI findings AxialT2WI showed mild encephalatrophy,espically in the white matter(arrows indicate),and slight enlargment of the bilateral ventricles (Panel 2a). Coronal FLAIR image showed abnormal hyperintense signals in bilateral periventricular area(arrows indicate,Panel 2b).Axial DWI showed abnormal hypointense signal in the deep part of bilateral temporo?occipital lobe beside lateral ventricle(arrows indicate,Panel 2c).Axial ADC showed hyperintensities in the lesion(arrow indicates,Panel 2d). Figure 3 MRSshoweddecreaseofNAA,Cr,ChoandNAA/(Cho+Cr)inleft periventricular regions,which reflected of neuronal damage and malformation in white matter myelination and suggested metabolic disease.

三、基因檢測

先證者存在MMACHC基因復合雜合突變,包括錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln)和無義突變c.609G>A(p.Trp203X),符合MMAcblC型的診斷(圖4a).先證者之弟亦存在MMACHC基因復合雜合突變,包括錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln)和無義突變c.609G>A(p.Trp203X,圖4b).進一步對其父母行MMACHC基因檢測,提示錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln)源自其父(圖4c)、無義突變c.609G>A(p.Trp203X)源自其母(圖4d).2例患者最終明確診斷為MMAcblC型合并高同型半胱氨酸血癥.

四、治療

先證者明確診斷后即予甲鈷胺1 mg/d肌肉注射,左卡尼汀2 g/d靜脈滴注,以及利培酮0.50 g/次、2次/d口服控制幻視,共住院13 d,出院時幻視消失,雙下肢肌力4級、肌張力降低,攙扶可行走.出院后予以甲鈷胺1 mg/次、3次/d和左卡尼汀1 g/次、2次/d口服,并囑低蛋白飲食.出院后3個月門診隨訪,臨床癥狀好轉,雙下肢肌力5-級,可獨立行走,未再出現幻覺,復查血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析,丙酰肉堿降至正常值范圍,C3/C2比值0.27.先證者之弟明確診斷后予甲鈷胺1 mg/次、3次/d和左卡尼汀1 g/次、2次/d口服,囑低蛋白飲食.3個月后門診隨訪,語言復述能力較前好轉,注意力和計算力欠佳.

討 論

甲基丙二酸血癥是維生素B12代謝障礙性疾病,可以根據維生素B12在細胞內代謝障礙累及環(huán)節(jié)分型(圖5[4],表1).人體從食物中攝取的游離維生素B12在體內與內因子結合形成穩(wěn)定復合物,在回腸遠端與腸黏膜細胞膜受體結合(維生素B12轉運蛋白復合體)而被吸收.維生素B12進入細胞后自其轉運蛋白復合體釋放至細胞質內,在cblC蛋白催化下形成Co(Ⅱ)cbl蛋白(即帶2價電子的氧化態(tài)cbl蛋白),一部分轉運至線粒體內轉化為腺苷鈷胺素(AdoCbl),參與線粒體內支鏈氨基酸和奇數鏈脂肪酸代謝,人體必需的支鏈氨基酸和奇數鏈脂肪酸在分解代謝過程中生成甲基丙二酸,在甲基丙二酰輔酶A變位酶(MUT)和AdoCbl共同催化下生成琥珀酰輔酶A,參與三羧酸循環(huán),若MUT或AdoCbl代謝異常,可以導致甲基丙二酸、丙酸等中間代謝產物堆積,引起單純型甲基丙二酸血癥,包括cblA型、cblB型和mut型3種亞型;另一部分在細胞質內轉化為甲鈷胺(MeCbl),參與催化同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸[4],若同時出現AdoCbl和MeCbl合成不足,可以影響同型半胱氨酸和甲基丙二酸的代謝,使甲基丙二酸和同型半胱氨酸蓄積[1],導致甲基丙二酸血癥合并高同型半胱氨酸血癥,包括cblC型、cblD型、cblF型和cblJ型[6?7],尤以cblC型常見[2,8].

圖4 MMACHC基因檢測所見 4a 先證者存在MMACHC基因復合雜合突變,包括錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln,箭頭所示,左圖)以及無義突變c.609G>A(p.Trp203X,箭頭所示,右圖)4b 先證者之弟存在MMACHC基因復合雜合突變,包括錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln,箭頭所示,左圖)以及無義突變c.609G>A(p.Trp203X,箭頭所示,右圖) 4c 先證者之父親存在MMACHC基因錯義突變c.482G>A(p.Arg161Gln,箭頭所示) 4d 先證者之母存在MMACHC基因無義突變c.609G>A(p.Trp203X,箭頭所示)Figure 4 Analysis of MMACHC gene test Proband had compound heterozygous mutation in MMACHC gene,including missense mutation c.482G>A(p.Arg161Gln,arrow indicates,left panel)and nonsense mutation c.609G>A(p.Trp203X,arrow indicates,right panel,Panel 4a).Proband's younger brother had the same compound herterozygous mutation as the proband(arrows indicate,Panel 4b).The proband's father canrried MMACHC gene missense mutation c.482G>A(p.Arg161Gln,arrow indicates,Panel 4c).The proband's mother carried MMACHC gene nonsense mutation c.609G>A(p.Trp203X,arrow indicates,Panel 4d).

大多數甲基丙二酸血癥為早發(fā)型,1歲內發(fā)病,表現為喂養(yǎng)困難、生長發(fā)育遲滯、癲發(fā)作、肌張力降低、酮癥酸中毒等,除神經系統癥狀外,還有肝腎功能障礙表現等,若無早期干預,病死率較高[9?10],因此,國外和國內部分地區(qū)已將甲基丙二酸血癥作為新生兒出生缺陷的常規(guī)篩查項目[8,11].晚發(fā)型甲基丙二酸血癥患者少見,臨床表現多樣,既往有文獻報道,1歲至學齡期前發(fā)病的患兒以溶血性尿毒綜合征(HUS)和肺動脈高壓為主要表現,而青少年期或成年期發(fā)病的患者則以不典型神經精神癥狀為主要表現或僅表現為學習困難、情緒障礙等,還可合并共濟失調、厭食、癲發(fā)作等,臨床明確診斷困難,常延誤治療[12?13].本研究家系中先證者以學習成績下降、性格改變?yōu)槭装l(fā)癥狀,病程中出現幻覺,逐漸出現雙下肢無力,體格檢查可見雙下肢肌力下降、下肢深淺感覺對稱性減弱、腱反射減退或消失等周圍神經損害體征,均支持晚發(fā)型甲基丙二酸血癥的診斷,進一步行遺傳代謝性疾病的血漿氨基酸和酰基肉堿譜分析,明確診斷.與既往文獻報道的晚發(fā)型甲基丙二酸血癥相似,先證者之弟僅出現學習成績差、易怒等癥狀,一直未引起重視,待先證者明確診斷后,行基因檢測才確定亦存在MMACHC基因突變.先證者頭部MRI突出表現為腦萎縮、白質髓鞘化不良,與既往文獻報道的甲基丙二酸血癥典型影像學改變相符[13?16].

圖5 維生素B12在細胞內代謝障礙累及環(huán)節(jié)以及甲基丙二酸血癥各亞型[4]:cblA型、cblB型和mut型僅累及AdoCbl或MUT蛋白,引起單純甲基丙二酸血癥;cblC型、cblD型和cblF型導致AdoCbl和MeCbl蛋白合成障礙,引起甲基丙二酸血癥合并高同型半胱氨酸血癥Figure 5 Links and different subtypes of MMA caused by intracellular metabolism disorder of vitamin B12[4].cblA type,cblB type and mut type only affect AdoCbl and MUT protein,and cause simple MMA.cblC type,cblD type and cblF type induce the disorder of anabolism of AdoCbl and MeCbl protein and result in MMA complicated with hyperhomocysteinemia.

表1 甲基丙二酸各亞型相關基因Table 1. Different type of MMA and corresponding gene

MMAcblC型致病基因為MMACHC基因,定位于1p34.1,共包含5個外顯子,全長10 800 bp,編碼282個氨基酸殘端蛋白即cblC蛋白,該蛋白在催化維生素B12向AdoCbl和MeCbl轉化過程中發(fā)揮重要作用[2].本研究家系中先證者及其弟經基因檢測明確診斷為MMAcblC型,系MMACHC基因復合雜合突變所致.其中,c.609G>A為無義突變,可使第203位色氨酸轉錄提前終止,該變異位點為東亞地區(qū)最常見變異位點,占40%～60%[8,17?19],該位點純合突變多與早發(fā)型甲基丙二酸血癥有關[19];c.482G>A為錯義突變,可使第161位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Liu等[17]報告8例攜帶c.482G>A突變的患者,僅1例于4歲前發(fā)病,余均于4歲后發(fā)病,提示攜帶錯義突變c.482G>A的患者臨床表型多為晚發(fā)型.

本研究家系中先證者一經明確診斷即予甲鈷胺、左卡尼汀治療,早期即有效控制癥狀,治療3個月后復查血漿丙酰肉堿和C3/C2比值明顯下降,提示為MMAcblC型.既往研究顯示,多數晚發(fā)型MMAcblC型為維生素B12依賴型,建議早期肌肉注射或皮下注射維生素B12(1 mg/d),同時予低蛋白飲食(每日蛋白質攝入量<0.80 g/kg),補充左旋肉堿[50～100 mg/(kg.d)],提高蛋氨酸水平、降低同型半胱氨酸和甲基丙二酸水平,改善臨床癥狀[4,20?21].

晚發(fā)型甲基丙二酸血癥臨床罕見,但屬可治性遺傳性疾病,對維生素B12治療反應良好,如果能夠及時識別其不典型臨床表現,通過特異性生物學指標和基因檢測早期診斷、及時治療,對患者預后意義重大.

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Analysis of clinical phenotype and genetic mutation with outcome evaluation in one family of vitamin B12?dependent methylmalonic aciduria

LI Jing1,SUN Yi?ming2,OU Li?yu1,ZHU Yu?ling1,WANG Liang1,LI Huan1,ZHANG Cheng11Department of Neurology,2Department of Health Care Clinic,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China

LI Jing and SUN Yi?ming contributed equally to this study

ZHANG Cheng(Email:zhangch6@mail.sysu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the clinicalfeatures,genetic mutation and vitamin B12therapeutive effectiveness in vitamin B12?dependent methylmalonic acidemia(MMA).MethodsClinical data in a pedigree of 4 members with vitamin B12?dependent MMA was collected.Peripheral blood samples were collected for plasma amino acids and acylcarnitines and gene muatation analysis.The therapeutic efficacy ofvitamin B12was evaluated.ResultsThe initialpresentations ofthe proband were underachievement and personality changes in 12?year old,and accompanied by visual hallucinations and weakness of lower limbs during the course of disease.The younger brother of the proband presented with bad?temper and lower acheivement.The analysis of plasma amino acid and acylcarnitine showed that proband and his younger brother's plasma propionylcarnitine and propionylcarnitine/acetylcarnitine ratio,and the level of methylmalonic acid in urine were increased significantly. Compound heterozygeous mutation of c.482G>A(p.Arg161Gln)and c.609G>A(p.Trp203X)in MMACHC gene were seen in the proband and her younger brother.Her father carried MMACHC gene missense mutation c.482G>A(p.Arg161Gln),while her mother carried MMACHC gene nonsense mutation c.609G>A(p.Trp203X).Symptoms of the proband were improved after vitamin B12therapy.ConclusionsThe late?onset vitamin B12?dependent MMA is caused by compound heterozygote mutation of MMACHC gene.It had good responsive to vitamin B12therapy.Early diagnosis and timely treatment may play a critical role for the outcomes of patients with this disease.

Methylmalonic acid; Metabolism,inborn errors; Vitamin B12; Phenotype;Genes; Mutation; Pedigree

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.07.009

國家自然科學基金資助項目(項目編號:81471280);廣東省廣州市2015年產學研專項項目(項目編號:1561000153);國家自然科學基金青年科學基金資助項目(項目編號:81601087);廣東省科學技術廳2014年度公益研究與能力建設專項資金資助項目(項目編號:2014A020212130);國家自然科學基金資助項目(項目編號:81271401);國家自然科學基金-廣東省聯合基金重點資助項目(項目編號:U1032004)

利婧、孫毅明并列為本文第一作者

510080廣州,中山大學附屬第一醫(yī)院神經科[利婧、歐俐羽(現在廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院神經內科,郵政編碼:530011)、朱瑜齡、王倞、李歡、張成],保健科(孫毅明)

張成(Email:zhangch6@mail.sysu.edu.cn)

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81471280,81271401),2015 Production,Study and Research Special Project of Guangzhou,Guangdong Province,China(No.1561000153),the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists(No.81601087),Non?Profit Study and Capability Building Special Fund Support Project of Guangdong Provincial Department of Science and Technology,China in the Year 2014(No.2014A020212130),and Joint Fund of National Natural Science Foundation of China and Natural Science Foundation of Guangdong Province,China(No.U1032004).

2017?06?12)