維吾爾族結(jié)腸癌患者UGT1A1基因多態(tài)性與伊立替康毒性的相關(guān)性

孫建+姜婷+田宇+毛於安

【摘要】 目的：評(píng)價(jià)維吾爾族結(jié)腸癌患者尿苷二磷酸葡糖苷酸轉(zhuǎn)移酶1A（UGT1A1）基因多態(tài)性與伊立替康治療相關(guān)不良反應(yīng)之間的關(guān)系。方法：選取2014年2月-2016年2月本院收治的維吾爾族結(jié)腸癌患者118例及漢族結(jié)腸癌患者100例，采用PCR法擴(kuò)增目的基因片段直接測(cè)序法分析UGT1A1基因多態(tài)性，記錄維吾爾族和漢族結(jié)腸癌患者化療中出現(xiàn)的不良反應(yīng)情況，比較不同基因型患者使用伊立替康后腹瀉及白細(xì)胞減少不良反應(yīng)發(fā)生率的差異。結(jié)果：118例維吾爾族患者中TA6/6野生型24例（20.3%），TA6/7雜合型25例（21.2%），TA7/7純合型69例（58.5%）；100例漢族結(jié)腸癌患者中TA6/6野生型45例（45.0%），TA6/7雜合型33例（33.0%），TA7/7純合型22例（22.0%），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=30.491，P<0.05）。維吾爾族結(jié)腸癌患者中，TA6/6、TA6/7和TA7/7各基因型發(fā)生Ⅲ度以上腹瀉者分別為5例（20.8%）、7例（28.0%）和45例（65.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=19.285，P<0.05）；發(fā)生Ⅲ度以上中性粒細(xì)胞減少者分別為3例（12.5%）、4例（16.0%）和12例（17.4%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.316，P>0.05）。結(jié)論：UGT1A1*28純合基因型TA7/7在維吾爾族結(jié)腸癌患者中分布較高，接受伊立替康化療后腹瀉發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，UGT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)有助于輔助臨床選擇合適的化療方案。

【關(guān)鍵詞】 伊立替康； 維吾爾族； 結(jié)腸癌； UGT1A1基因多態(tài)性

【Abstract】 Objective：To evaluate the correlation of Uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A（UGT1A1） gene polymorphism in Uygur colorectal cancer patients and Irinotecan adverse reactions.Method：From February 2013 to February 2016， Peripheral blood of 118 Uygur colorectal cancer patients and 100 Han Chinese colorectal cancer patients treated in our hospital were collected，the gene was amplified by polymerase chain reaction（PCR） fragment，UGT1A gene polymorphism were analysed，the adverse reactions incidence rate of Uygur and Han were recorded，and the incidence rate of diarrhea and leukopenia in different genotype patients who receiving Irinotecan treatment were compared.Result：118 cases of Uygur patients，TA6/6 wild genotype 24 cases（20.3%），TA6/7 heterozygous genotype 25 cases（21.2%）， TA7/7 homozygous genotype 69 cases（58.5%）.100 cases of Han Chinese patients had TA6/6 wild genotype 45 cases（45.0%），TA6/7 heterozygous genotype 33 cases（33.0%），TA7/7 homozygous genotype 22 cases（22.0%），the difference of two ethnics was statistic significant（ 字2=30.491，P<0.05）.In Uygur patients，diarrhea above Ⅲ degrees of TA6/6，TA6/7 and TA7/7 genotype were 5 cases（20.8%），7 cases（28.0%） and 45 cases（65.2%） ，the difference was statistic significant（ 字2=19.285，P<0.05）.Neutropenia above Ⅲ degrees of TA6/6，TA6/7 and TA7/7 genotype were 3 cases（12.5%），4 cases （16.0%）and 12 cases（17.4%），the difference had no statistic significant（ 字2=0.316，P>0.05）.Conclusion：The distribute of UGT1A1*28 TA7/7 homozygous genotype in Uygur colorectal cancer patients is high，and the risk of diarrhea after receiving Irinotecan treatment is increased，UGT1A polymorphism detection is contributes to choose appropriate chemotherapies.

【Key words】 Irinotecan； Uygur； Colorectal cancer； UGT1A1 gene polymorphismendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.017

伊立替康（Irinotecan CPT-11）為消化系統(tǒng)腫瘤常用化療藥物之一[1]，由于其所引起特異性不良反應(yīng)Ⅲ～Ⅳ度遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生率較高[2]，在國(guó)外及我國(guó)早期開(kāi)展的CPT-11注冊(cè)臨床研究中也曾發(fā)生因嚴(yán)重遲發(fā)性腹瀉導(dǎo)致死亡的病例[3-4]；故對(duì)我國(guó)醫(yī)生而言，使用含CPT-11方案均存有顧慮。近期有研究發(fā)現(xiàn)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A1基因多態(tài)性與腹瀉發(fā)生顯著相關(guān)，其主要以UGT1A1*28位點(diǎn)的突變?yōu)橹鳎延醒芯孔C實(shí)這一推論[5-7]。UGTl Al*28突變型患者遲發(fā)性腹瀉或中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率明顯升高，而野生基因型的遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)發(fā)生率則顯著低于純合變異基因型患者[8]，國(guó)內(nèi)研究顯示UGT1A1*28突變基因的頻率在中國(guó)人分布較低[9]，這就解釋了中國(guó)人應(yīng)用含CPT-11方案發(fā)生遲發(fā)性腹瀉較少的原因。但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究均以漢族人群為樣本，作為新疆特有少數(shù)民族之一維吾爾族人群UGT1A1*28基因突變及其與CPT-11的毒性作用關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)本院近2年收治的118例維吾爾族大腸癌患者應(yīng)用CPT-11聯(lián)合氟尿嘧啶和亞葉酸鈣方案進(jìn)行治療，評(píng)價(jià)CPT-11毒性與UGT1A1基因多態(tài)性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月-2016年2月本院住院維吾爾族結(jié)腸癌118例，其中男72例，女46例，年齡42～68歲，90例行結(jié)腸癌根治手術(shù)，18例行減癥手術(shù)，根據(jù)AJCC2010年TNM分期，Ⅱ期73例，Ⅲ期32例，Ⅳ期13例，一線治療65例；二線治療53例；另選取同期漢族結(jié)腸癌患者100例，其中男65例，女35例，年齡46～71歲，其中72例行結(jié)腸癌根治手術(shù)，28例行減癥手術(shù)；（均經(jīng)手術(shù)或活檢病理證實(shí)為結(jié)腸腺癌，未經(jīng)化療或距末次化療4周以上）。根據(jù)AJCC 2010年TNM分期，Ⅱ期68例，Ⅲ期23例，Ⅳ期9例。一線治療68例；二線治療32例，納入病例均為連續(xù)病例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 化療方案 第1天伊立替康180 mg/m2靜脈滴注，亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注；第1～2天5-FU 400 mg/m2靜脈推注后5-FU 600 mg/m2持續(xù)靜脈滴注22 h；14 d為1個(gè)周期。上述治療方案至少進(jìn)行2個(gè)周期，在第2周期末進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。

1.3 毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)國(guó)立癌癥研究所通用毒性標(biāo)準(zhǔn)（NCI-CTC）3.0版對(duì)中性粒細(xì)胞減少和遲發(fā)性腹瀉進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 DNA提取、PCR反應(yīng)和UGT1A1基因序列分析 收集大腸癌患者治療前外周抗凝血2 mL凍存在-20 ℃的冰箱，根據(jù)外周血DNA提取試劑盒（北京天根公司）操作手冊(cè)，分批次統(tǒng)一提取基因組DNA。PCR法擴(kuò)增UGT1A1*28基因的相應(yīng)片段，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，每25 μL的PCR反應(yīng)包括5 ng模板DNA，10×KOD plus buffer，0.4 mmol/L MgSO4，1mmol/L dNTPs，0.25 μmol/L正向和反向引物和0.5 U KOD plus酶（日本TOYOBO公司）。正向引物5-GCCAGTTCAACTGTTGTTGC-3，反向引物5-GTCCGTCAGCATGACATCAA-3。PCR的反應(yīng)條件：初始變性94 ℃，2 min 30 s；變性94 ℃ 30 s；退火57 ℃，1 min；延伸68 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸7min。應(yīng)用ABI-3730測(cè)序儀雙向測(cè)序分析PCR產(chǎn)物，Polyphred 5.04對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)分析，全部SNP經(jīng)過(guò)人工校讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成。以遺傳平衡吻合度 字2檢驗(yàn)判斷群體基因型頻率分布是否符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium， HWE），上述檢驗(yàn)使用HaploView4.2a軟件完成。采用 字2檢驗(yàn)比較維吾爾族與漢族大腸癌患者之間的基因型分布差異，以及各基因型之間遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少發(fā)生率的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維吾爾族和漢族大腸癌患者UGT1A1基因多態(tài)性分布情況比較 維吾爾族和漢族大腸癌患者在UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)28位點(diǎn)TA6/6野生型、TA6/7雜合型、純合突變型TA7/7的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=30.491，P<0.05），可認(rèn)為維吾爾族和漢族大腸癌患者UGT1A1的基因多態(tài)性不同，見(jiàn)表1。

2.2 維吾爾族和漢族大腸癌患者化療毒副反應(yīng)情況 維吾爾族和漢族大腸癌患者均完成至少2周期化療，不良反應(yīng)主要是骨髓抑制、腹瀉，均為Ⅰ～Ⅲ度，無(wú)Ⅳ度不良反應(yīng)。無(wú)脫發(fā)、無(wú)化療相關(guān)死亡，2周期化療不良反應(yīng)按較重者計(jì)數(shù)。其中維吾爾族結(jié)腸癌患者不同腹瀉程度的基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=19.285，P<0.05），可認(rèn)為不同腹瀉程度的基因型表達(dá)不同，而不同白細(xì)胞減少程度的基因型，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.316，P>0.05），尚不能認(rèn)為不同白細(xì)胞減少程度的基因表達(dá)型不同。漢族結(jié)腸癌患者不同腹瀉程度及不同白細(xì)胞減少程度的基因型表達(dá)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.413，P>0.05； 字2=0.875，P>0.05），尚不能認(rèn)為不同腹瀉程度及不同白細(xì)胞減少程度的基因表達(dá)型不同。見(jiàn)表2、3。

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)結(jié)腸發(fā)病率及死亡率明顯升高，其初診患者中約25%病情已進(jìn)展至中晚期。另有超過(guò)25%結(jié)直腸癌患者在第一次手術(shù)后仍將復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。故化療是中晚期結(jié)直腸癌主要治療手段。近年來(lái)隨著抗腫瘤藥物研發(fā)不斷進(jìn)步，晚期結(jié)直腸癌的療效有了顯著提高。目前治療結(jié)直腸癌的化療方案基本上離不開(kāi)伊立替康、5-FU及草酸鉑三種藥物，構(gòu)成FOLFOX方案（草酸鉑+5FU/LV）和FOLFIRI方案（CPT-11+5FU/LV）。endprint

UGT1A1基因編碼UGT是一種Ⅱ相代謝酶，屬于UGTs基因家族中的一員，其產(chǎn)物尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1的主要作用是使各種不同外源性藥物和內(nèi)生底物葡萄糖醛酸化，增加底物的極性，以便更好地從體內(nèi)被清除，如膽紅素、伊立替康等[10]。UGT1A1基因以插入、單核苷酸多態(tài)性等形式表現(xiàn)出序列間很大的個(gè)體差異，其與結(jié)直腸癌發(fā)病及治療間的關(guān)系一直是人們研究的熱點(diǎn)[11-12]。伊立替康是半合成水溶性喜樹(shù)堿衍生物，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)羧酸酯酶催化生成7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿（SN-38），后者是一種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶Ⅰ抑制劑（Topo Ⅰ）通過(guò)抑制Topo Ⅰ誘導(dǎo)DNA單鏈損傷、阻斷DNA復(fù)制而產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。UGT1A1能將SN-38轉(zhuǎn)化成無(wú)活性SN-38葡萄糖醛酸苷，從膽汁排出，使健康細(xì)胞免受伊立替康毒性影響。但UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)具有多態(tài)性，其TATA盒區(qū)域包含5～8個(gè)TA重復(fù)序列，隨著TA重復(fù)序列數(shù)目的增加，UGT1A1表達(dá)下降。通常一般人帶有6/6 TA重復(fù)（基因型為TA6/6），而少數(shù)人是6/7或7/7個(gè)TA重復(fù)。有研究表明UGT1A1活性越高形成SN-38G越多，藥物不良反應(yīng)越小，TA6/6野生基因型患者中性粒細(xì)胞減少與遲發(fā)性腹瀉等不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于TA7/7純合變異基因型患者，因此UGT1A1是決定CPT-11藥代及不良反應(yīng)的關(guān)鍵因素，國(guó)內(nèi)外研究表明UGT1A1基因多態(tài)性能預(yù)測(cè)CPT-11的毒性反應(yīng)[13-14]。

國(guó)內(nèi)研究表明，UGT1A1基因表達(dá)在亞洲人、高加索人和非洲人種之間存在明顯人種差異，其中UGTIAI*28純合突變型TA7/7在亞洲人中僅為0%～5%，遠(yuǎn)低于非洲人和高加索人中的頻率12%～27%和5%～15%，提示不同民族間UGT1A1基因表達(dá)有差異性[15]。明確維吾爾族人群UGT1A1基因多態(tài)性分布情況對(duì)維吾爾族大腸癌患者個(gè)體化治療有指導(dǎo)意義。本研究中維吾爾族大腸癌患者TA6/6野生型占20.3%，TA6/7雜合型占21.2%，TA7/7純合型占58.5%，而漢族人群上述比例為45.0%、33.0%和22.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示維吾爾族人群與漢族人UGT1A1基因分布可能有差異性，維吾爾族人群中TA7/7純合型表達(dá)比例較目前報(bào)道者偏高，不排除有樣本誤差，后續(xù)將在擴(kuò)大樣本量基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究。

維吾爾族大腸癌患者治療過(guò)程中，Ⅲ度腹瀉不良反應(yīng)在TA7/7純合基因型中出現(xiàn)比例為65.2%，高于TA6/6野生型出現(xiàn)比例20.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示不同基因型患者出現(xiàn)腹瀉比率不同，TA7/7純合基因型患者出現(xiàn)Ⅲ度腹瀉副反應(yīng)可能性更大，該結(jié)果與文獻(xiàn)[8]相符；TA6/6野生型、TA6/7雜合型、TA7/7純合型出現(xiàn)Ⅲ度白細(xì)胞減少副反應(yīng)比率分別為12.5%、16.0%、17.4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），該結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果不同，分析可能與維吾爾族患者飲食營(yíng)養(yǎng)狀況及化療過(guò)程中輔助治療有關(guān)。

綜上所述，維吾爾族人群UGT1A1基因多態(tài)性頻率高，TA7/7純合基因型占大多數(shù)，腹瀉副反應(yīng)發(fā)生率較高，該基因型與較高的伊立替康嚴(yán)重毒性反應(yīng)關(guān)系密切，建議維吾爾族大腸癌患者化療過(guò)程中選擇含CPT-11方案進(jìn)行治療時(shí)應(yīng)進(jìn)行UGT1A1基因多態(tài)性檢測(cè)，TA7/7純合基因型謹(jǐn)慎或避免選擇含CPT-11方案化療。

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