D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥絨氈層細(xì)胞程序化死亡與活性氧代謝

劉子涵，石曉藝，閆鵬嬌，段陽(yáng)，耿興俠，葉佳麗，李莎，楊雪桐，張高明，賈雨林，張玲麗，宋喜悅

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D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥絨氈層細(xì)胞程序化死亡與活性氧代謝

劉子涵，石曉藝，閆鵬嬌，段陽(yáng)，耿興俠，葉佳麗，李莎，楊雪桐，張高明，賈雨林，張玲麗，宋喜悅

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

D2型細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥（cytoplasmic male sterility，CMS）的重要胞質(zhì)來源，深入研究其敗育機(jī)理對(duì)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用具有重要價(jià)值。以3種同核異質(zhì)D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥Va87B1-706A、C687B1-706A、Ju87B1-706A及其相應(yīng)保持系706B為試材，通過體式顯微鏡和DAPI染色分別在四分體時(shí)期、單核早期、單核晚期、二核期和三核期觀察小麥花藥的外形和小孢子發(fā)育的形態(tài)；利用掃描電鏡和KI-I2染色分析三核期花藥外皮層、內(nèi)皮層、烏氏體和花粉粒的表型及敗育特點(diǎn)；采用石蠟切片和DNA ladder的技術(shù)觀察不同發(fā)育時(shí)期D2型不育系和保持系小麥花藥絨氈層細(xì)胞形態(tài)變化特征以及絨氈層細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）的過程；測(cè)定花藥發(fā)育過程中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（hydrogen peroxidase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）的活性以及非酶物質(zhì)還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量變化；同時(shí)利用RT-PCR技術(shù)對(duì)部分抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。與保持系706B比較，3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥在三核期均表現(xiàn)出外皮層表皮褶皺、烏氏體排列稀疏散亂以及小孢子皺縮、表皮粗糙和萌發(fā)孔閉合的不育特征，敗育類型為典敗和染敗；自單核晚期開始3種不育小麥的小孢子發(fā)生紊亂；石蠟切片觀察絨氈層細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)不育系均比保持系延遲一個(gè)時(shí)期在二核期發(fā)生解體，并于三核期完全降解；進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡DNA小片段發(fā)現(xiàn)3種不育系花藥絨氈層的DNA損傷均起始于單核晚期，絨氈層PCD比保持系延遲一個(gè)時(shí)期啟動(dòng)，并且優(yōu)先細(xì)胞學(xué)表型檢測(cè)到凋亡；生理指標(biāo)測(cè)定和定量分析的結(jié)果說明絨氈層細(xì)胞的延遲凋亡和小孢子的結(jié)構(gòu)異常與不育系花藥內(nèi)活性氧的過度積累、抗氧化酶活性的異常變化、非酶促抗氧化物質(zhì)的嚴(yán)重下調(diào)以及部分抗氧化酶相關(guān)基因在兩系花藥中表達(dá)水平的嚴(yán)重差異密切相關(guān)。D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥敗育的關(guān)鍵時(shí)期是單核晚期，絨氈層PCD的延遲啟動(dòng)誘導(dǎo)了活性氧的過量積累，進(jìn)一步破壞了抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而造成絨氈層細(xì)胞形態(tài)異常，最終導(dǎo)致D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的敗育。

小麥；D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育；絨氈層細(xì)胞程序化死亡；活性氧代謝；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】作物雜種優(yōu)勢(shì)是自然界普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象，實(shí)踐證明雜交種具有產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)以及抗性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[1]，許多植物雜交種的大面積推廣已取得一定的經(jīng)濟(jì)效益[2]。因此，深入研究與開發(fā)利用作物雜種優(yōu)勢(shì)在提高小麥的品質(zhì)和單位面積產(chǎn)量等方面具有重要作用，而雄性不育是實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)利用的一條重要途徑，對(duì)雄性不育機(jī)理的研究一直引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的廣泛關(guān)注[3]。【前人研究進(jìn)展】近50多年來，雜種小麥因?yàn)橥庠醇?xì)胞質(zhì)的引用而得以廣泛應(yīng)用。1951年，Kihara創(chuàng)制的尾狀山羊草（）異質(zhì)不育系開啟了小麥異質(zhì)雄性不育的研究，之后相繼獲得130多種質(zhì)核雜交小麥。其中，D2型細(xì)胞質(zhì)具有一定應(yīng)用潛力[4]。D2型細(xì)胞質(zhì)對(duì)小麥主要農(nóng)藝性狀無不利效應(yīng)，且能引起許多小麥品種（系）雄性不育[5-6]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在D2型細(xì)胞質(zhì)中，特別是牡山羊草（）細(xì)胞質(zhì)對(duì)雜交小麥的開發(fā)利用價(jià)值最大，并且具有易恢復(fù)、增加普通小麥的生長(zhǎng)勢(shì)、改良小麥品質(zhì)以及提高小麥對(duì)白粉病的抗性等優(yōu)點(diǎn)，在雜交小麥育種和生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值[7-8]。盡管科學(xué)研究者們證明D2型細(xì)胞質(zhì)對(duì)普通小麥的農(nóng)藝性狀沒有不利效應(yīng)[9-10]，但對(duì)這種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其敗育機(jī)理并不是很明確，且國(guó)內(nèi)外研究甚少。細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）在多種生物的生長(zhǎng)過程中占有重要地位，是一種由基因控制有序的選擇性細(xì)胞凋亡的過程[11]。在植物發(fā)育過程中，一些組織和器官的發(fā)育都會(huì)發(fā)生細(xì)胞程序化死亡過程，如許多特定組織細(xì)胞的分化、生殖器官的發(fā)育、葉片的自然凋亡、根冠細(xì)胞的消失以及糊粉層的瓦解等[12-14]。目前，許多學(xué)者也證實(shí)了花藥絨氈層降解的基本特征與細(xì)胞程序化死亡的過程相符[15-17]，作為花藥壁最內(nèi)層的絨氈層直接和小孢子接觸，適時(shí)降解的絨氈層能為小孢子正常生長(zhǎng)發(fā)育準(zhǔn)確地提供脂肪、蛋白質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在小孢子發(fā)育過程中起著極其重要的作用。絨氈層細(xì)胞的PCD過程提前（或延遲）均會(huì)導(dǎo)致植物（如水稻、玉米、向日葵、小麥等）花粉敗育[18-21]。目前，人們普遍認(rèn)為，細(xì)胞程序化死亡與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的代謝之間具有緊密的聯(lián)系，對(duì)于PCD與ROS的研究大多集中在生物脅迫和非生物脅迫對(duì)微生物、昆蟲、動(dòng)物以及植物葉片的PCD影響[22-25]，而對(duì)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥絨氈層的自然凋亡過程與ROS關(guān)系的研究較少。在植物體中，細(xì)胞中所有的活動(dòng)所需要的能量都離不開線粒體中的呼吸作用。在正常情況下，植物線粒體產(chǎn)生的活性氧能夠抵御外來傷害，但一旦發(fā)生代謝紊亂，過量的ROS就會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的多種物質(zhì)相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞代謝的平衡。植物在面臨傷害的過程中形成一套可有效阻止或延遲氧化傷害的防御機(jī)制，即酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)。其中，酶促抗氧化系統(tǒng)中的SOD酶能將超氧自由基歧化為H2O2和O2，POD協(xié)同CAT能同時(shí)清除生物體內(nèi)過量的過氧化氫[26]。APX和GPX在過量H2O2的刺激下能直接參與植物的氧化反應(yīng)，同時(shí)GSH被氧化成GSSG[27]。其中，馬翎健等[28]研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥酶活性，發(fā)現(xiàn)小麥ROS含量升高、SOD和CAT活性降低，最終導(dǎo)致膜損傷，從而造成細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥花粉敗育。非酶促抗氧化系統(tǒng)中，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)也可以消除過多的H2O2進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使植物向有利的方向發(fā)育[29]。研究表明不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥AsA和GSH代謝的異常是導(dǎo)致花粉敗育的根本原因[30]。目前，研究表明ROS與植物細(xì)胞的程序化死亡有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在PCD過程中ROS起到2種作用，一種是ROS作為信號(hào)分子啟動(dòng)了細(xì)胞調(diào)亡的反應(yīng)，一種是直接導(dǎo)致了細(xì)胞的PCD過程[12]。【本研究切入點(diǎn)】小麥雄性不育的形成機(jī)理十分復(fù)雜，近年來，探究細(xì)胞質(zhì)雄性不育敗育的原因已成為研究的熱點(diǎn)問題。而且關(guān)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究一般采用核遺傳背景不同或者單一的材料進(jìn)行比較，具有很大的局限性。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選用3種同核異質(zhì)D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥，在消除核背景遺傳差異的前提下，從細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)等方面，利用掃描電鏡、DAPI染色、石蠟切片、DNA ladder、生理指標(biāo)測(cè)定和qRT-PCR的方法，客觀詳細(xì)地分析了3種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系絨氈層PCD、ROS及抗氧化系統(tǒng)三者之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示雄性敗育原因，為細(xì)胞質(zhì)不育類型的劃分以及探索敗育機(jī)理開拓了新的方向。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料Va87B1-706A、C687B1-706A和Ju87B1-706A，其細(xì)胞質(zhì)分別源于瓦維洛夫山羊草（）、粗厚山羊草（）和牡山羊草（）。3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以及同型保持系706B的細(xì)胞質(zhì)源于普通小麥細(xì)胞質(zhì)（）。所有不育系均與保持系706B于楊凌回交20代以上，不育性穩(wěn)定。所有試驗(yàn)材料均在2014年10月和2015年10月播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)田。2015年4月，對(duì)所有不育系隨機(jī)選10株進(jìn)行自交套袋，并調(diào)查自交結(jié)實(shí)率（均為0），進(jìn)一步說明不育系的穩(wěn)定性（姚盟2015）。每種材料種植2行，行長(zhǎng)1 m，行間距0.25 m，株距6.7 cm，常規(guī)大田管理。

1.2 花藥及小孢子的表型觀察

于4月份選取3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以及同型保持系穗中部小穗基部的花藥，用醋酸洋紅進(jìn)行壓片鏡檢，確定小麥的不同發(fā)育時(shí)期（stage1，四分體時(shí)期、stage2，單核早期、stage3，單核晚期、stage4，二核期和stage5，三核期）。通過已經(jīng)鑒定的小麥發(fā)育時(shí)期，記錄相應(yīng)的植株形態(tài)，確保材料時(shí)期的準(zhǔn)確性。利用體式顯微鏡（Motic K400）對(duì)不同時(shí)期的小花和花藥進(jìn)行觀察和拍照。按照王書平[31]的掃描電鏡方法觀察三核期的花藥，之后用導(dǎo)電膠將花藥外皮、內(nèi)皮和小孢子固定在銅臺(tái)上進(jìn)行噴金處理，用掃描電鏡（M-6360LV）觀察其表型結(jié)構(gòu)并拍照。利用FAA固定液固定不同時(shí)期的花藥，保存于4℃，用于DAPI染色和I2-K染色制片。

1.3 花藥絨氈層觀察

取出FAA固定液中各時(shí)期的花藥，參照王書平[31]的方法制作石蠟切片，切片厚度為10 μm，所有樣品制片在顯微鏡（Nikon ECLIPSE E600）下觀察并用NIS-Elements軟件拍照。

1.4 DNA的提取純化與DNA ladder的分析

取5個(gè)時(shí)期的花藥各0.25 g，參照王書平[31]的方法提取DNA并純化，將純化的DNA用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定濃度，取10 μg DNA于2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)（JY04S-3C）拍照。

1.5 生理指標(biāo)的測(cè)定

在4℃環(huán)境下，選取3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以及同型保持系5個(gè)時(shí)期的花藥進(jìn)行主要生理指標(biāo)的測(cè)定，重復(fù)3次，取其平均值。

1.5.1 活性氧（ROS）含量的測(cè)定 參照王書平[31]的方法測(cè)定超氧陰離子（O2-）和過氧化氫（H2O2）含量，參考Noreen等[32]方法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，并稍有改進(jìn)。

1.5.2 抗氧化酶活性的變化 參照Li等[33]方法并稍作修改測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性。參照楊冬業(yè)等[34]的方法測(cè)定過氧化氫酶（hydrogen peroxidase，CAT）活性。參照張悅等[27]方法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活性，并加以改進(jìn)。

1.5.3 非酶促抗氧化物質(zhì)含量的變化 按照黃志明等[35]方法測(cè)定還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH），并稍作改動(dòng)。

1.6 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)分析

1.6.1 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 采用TRIzol法提取3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及同型保持系花藥5個(gè)時(shí)期的總RNA。利用HiScriptTMQ Select RT SuperMix for qPCR（Vazyme 南京）進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，方法參考說明書，cDNA產(chǎn)物用于RT-PCR反應(yīng)。

1.6.2 SOD、CAT和APX酶基因的半定量分析及熒光定量PCR分析 所用引物序列（電子附表1）由上海生物工程股份有限公司合成。RT-PCR參照石曉藝[36]方法進(jìn)行操作，利用凝膠成像系統(tǒng)（JY04S- 3C）拍照。

用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 試劑盒（Vazyme 南京），按照試劑盒說明書在ABI PRISM 7000上進(jìn)行操作。每個(gè)模板設(shè)3次重復(fù)。目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，利用SSR法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的表型特征

從不育系和保持系5個(gè)發(fā)育時(shí)期小花的結(jié)果可以看出，不育系的雌蕊發(fā)育均正常。然而，從單核晚期開始不育系的花藥比706B小且顏色偏淡（圖1）。尤其在三核期時(shí)，所有不育系花藥端部不開裂，底部不分叉，捻開后沒有花粉或者只可見少量花粉散出（圖1和圖2）。而保持系706B花藥飽滿且顏色亮黃，兩端分叉明顯，花藥中有大量花粉散出（圖1和圖2）。

A—E：Va87B1-706A；F—J：C687B1-706A；K—O：Ju87B1-706A；P—T：706B。A、F、K和P：四分體時(shí)期；B、G、L和Q：?jiǎn)魏嗽缙冢籆、H、M和R：?jiǎn)魏送砥冢籇、I、N和S：二核期；E、J、O和T：三核期。不育系花藥從四分體時(shí)期到單核早期正常發(fā)育，但是從單核晚期開始不育系的花藥要比706B偏小且顏色偏淡。尤其在三核期時(shí)，所有不育系花藥干癟，不散粉。標(biāo)尺為 0.5 mm

為進(jìn)一步觀察不育系三核期花藥和小孢子的敗育特征，利用掃描電鏡觀察不育系和保持系三核期花藥的外皮層、內(nèi)皮層和小孢子的形態(tài)。結(jié)果顯示，保持系的外皮層表皮光滑平整，細(xì)胞排列整齊緊密有序，而不育系的外皮層表皮褶皺粗糙，細(xì)胞排列散亂且沒有規(guī)則，細(xì)胞間相互疊加呈現(xiàn)出扭曲變形的不育特征（圖2）。內(nèi)皮層表面是由大量烏氏體覆蓋而成，從圖中可以看出保持系內(nèi)皮層表面烏氏體排列致密，形態(tài)規(guī)則且個(gè)體飽滿，而不育系內(nèi)皮層表面烏氏體呈現(xiàn)相互黏連、排列稀疏、大小不一的不育特征（圖2）。通過掃描電鏡觀察小孢子的特征，發(fā)現(xiàn)保持系的小孢子形狀圓潤(rùn)表面光滑，萌發(fā)孔呈現(xiàn)開放狀態(tài)。而不育系的小孢子表面粗糙且容易黏連微粒，形狀不規(guī)則，萌發(fā)孔閉合或皺縮（圖2）。

I2-KI染色鑒定結(jié)果顯示，3種不育系大部分花粉粒形態(tài)不規(guī)則有皺縮現(xiàn)象且不染色，少部分呈圓形且染色淺，因而敗育類型為典敗和染敗。保持系706B花粉粒經(jīng)染色后，絕大多數(shù)花粉粒被染成棕黑色且染色充分（圖2）。

以上結(jié)果表明，D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的質(zhì)核互作效應(yīng)嚴(yán)重影響了花藥和小孢子的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致完全雄性不育。

A1—A9：Va87B1-706A；B1—B9：C687B1-706A；C1—C9：Ju87B1-706A；D1—D9：706B；A1、A6、B1、B6、C1、C6、D1和D6：花藥；A2、A3、B2、B3、C2、C3、D2和D3：外皮層細(xì)胞；A4、A5、B4、B5、C4、C5、D4和D5：內(nèi)皮層細(xì)胞；Uby：烏氏體；A7-D7：碘染花粉粒；A8、A9、B8、B9、C8、C9、D8和D9：小孢子；Ap：萌發(fā)孔。保持系的外皮層表皮光滑平整，內(nèi)皮層表面烏氏體排列致密形態(tài)規(guī)則且個(gè)體飽滿，小孢子形狀圓潤(rùn)表面光滑；不育系外皮層表皮褶皺粗糙，細(xì)胞排列散亂，內(nèi)皮層表面烏氏體現(xiàn)相互黏連、排列稀疏，小孢子表面粗糙且容易黏連微粒，且敗育類型為典敗和染敗。A1、A6、B1、B6、C1、C6、D1和D6的標(biāo)尺為1mm；A2、B2、C2和D2的標(biāo)尺為100 μm；A7—A9、B7—B9、C7—C9和D7—D9的標(biāo)尺為50 μm；A3—A5、B3—B5、C—C5和D3—D5的標(biāo)尺為10 μm

A1-A9: Va87B1-706A; B1-B9: C687B1-706A; C1-C9: Ju87B1-706A; D1-D9: 706B. A1, A6, B1, B6, C1, C6, D1, and D6: anther; A2, A3, B2, B3, C2, C3, D2, and D3: outer epidermal cells; A4, A5, B4, B5, C4, C5, D4, and D5: inner epidermal cells; Uby: indicates the Ubisch bodies; A7, B7, C7 and D7: microspore of I2-KI staining. A8, A9, B8, B9, C8, C9, D8 and D9: microspores; Ap: indicate the germination aperture. The outer epidermal cells of fertile anthers appeared to be slippy and smooth, and the inner epidermal cells accumulated a lot of tight Ubisch bodies. The epidermis of fertile microspores was rounded and plump with a gymnotremoid germinal aperture. The outer epidermal cells of sterile anthers appeared to be adhesive and loose, and the inner epidermal cells accumulated less and more unconsolidated Ubisch bodies. The epidermis of the CMS microspores were crenate and extremely scabrous, with a malformed germinal aperture. Scale bars represent 1mm in A1, A6, B1, B6, C1, C6, D1, and D6; 100 μm in A2, B2, C2 and D2 ; 50 μm in A7 to A9, B7 to B9, C7 to C9, and D7 to D9; 10 μm in A3 to A5, B3 to B5, C3 to C5, and D3 to D5

圖2 三核期不育系和保持系花藥及小孢子外部形態(tài)及育性的比較

Fig. 2 Comparison of scanning electron micrograph observations, I2-KI staining, and anther morphology in Va87B1-706A, C687B1-706A, Ju87B1-706A and fertile wheat plants at the trinucleate stage

2.2 D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的細(xì)胞學(xué)特征

為進(jìn)一步探究D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系小孢子的發(fā)育，筆者分別對(duì)不同時(shí)期的花藥細(xì)胞進(jìn)行了DAPI染色觀察（圖3）。保持系706B和不育系的花粉母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成四分體，單核早期小孢子細(xì)胞核于中央。與保持系單核晚期圓形的小孢子不同，不育系小孢子呈不規(guī)則形狀且表面皺縮，細(xì)胞核位于萌發(fā)孔對(duì)側(cè)；二核期保持系小孢子出現(xiàn)圓形的營(yíng)養(yǎng)核和精核；在三核期，圓形的精核形成了2個(gè)梭形的精核，營(yíng)養(yǎng)核顏色變淺。不育系Va87B1-706A、C687B1-706A和Ju87B1-706A，二核期花粉粒能正常形成精核和營(yíng)養(yǎng)核，但有些細(xì)胞形狀不規(guī)則且營(yíng)養(yǎng)核模糊。而三核期大部分花粉粒細(xì)胞精核呈現(xiàn)圓形退化變小，不能形成2個(gè)梭形的精核，且有部分細(xì)胞呈空胞化，花粉敗育。

A—E：Va87B1-706A；F—J：C687B1-706A；K—O：Ju87B1-706A；P—T：706B；A、F、K和P：四分體時(shí)期；B、G、L和Q：?jiǎn)魏嗽缙冢籆、H、M和R：?jiǎn)魏送砥冢籇、I、N和S：二核期；E、J、O和T：三核期。不同于保持系小孢子的正常發(fā)育，不育系單核晚期細(xì)胞表面皺縮且呈不規(guī)則形狀；二核期花粉粒營(yíng)養(yǎng)核不清晰且細(xì)胞形狀不規(guī)則；而三核期大部分花粉粒精核呈現(xiàn)圓形退化變小，且有部分細(xì)胞發(fā)生空胞化。標(biāo)尺為 50 mm

2.3 花藥絨氈層細(xì)胞程序化死亡的觀察

為了觀察D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥花藥發(fā)育過程中絨氈層細(xì)胞程序化死亡啟動(dòng)時(shí)期的異常變化，并進(jìn)一步確定敗育時(shí)期和原因，利用甲苯胺藍(lán)染色法觀察不育系和保持系不同發(fā)育時(shí)期花藥絨氈層的變化（圖4）。在四分體時(shí)期，不育系和保持系花藥絨氈層體積明顯偏大，細(xì)胞質(zhì)濃厚染色深，花藥壁的中層結(jié)構(gòu)完整，呈帶狀分布。單核早期，不育系和保持系花藥絨氈層細(xì)胞質(zhì)染色依然很深，中層開始變窄，且絨氈層沒有明顯區(qū)別。到了單核晚期，不育系和保持系的中層細(xì)胞完全退化消失，而保持系的絨氈層開始降解，即啟動(dòng)了細(xì)胞程序化死亡的過程，此時(shí)期表現(xiàn)為絨氈層邊界模糊，并且能夠明顯地觀察到未退化的細(xì)胞核碎片及較多的細(xì)胞質(zhì)殘留。而不育系在此時(shí)期并沒有觀察到絨氈層的退化，且排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)由于絨氈層未及時(shí)發(fā)生降解，不能為小孢子發(fā)育提供重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而導(dǎo)致花粉發(fā)育畸形，形態(tài)異常。二核期和三核期，保持系的絨氈層完全降解，而不育系絨氈層細(xì)胞在二核期才開始降解，三核期降解不完全，依然能夠觀察到清晰的輪廓和解體的碎片。

以上結(jié)果表明，3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥花藥的絨氈層細(xì)胞在花藥發(fā)育過程中均發(fā)生了細(xì)胞凋亡的延遲啟動(dòng)，從而影響了小孢子的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致敗育的形成。因此，推斷D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥絨氈層的延遲降解可能為敗育的細(xì)胞學(xué)原因。

A—E：Va87B1-706A；F—J：C687B1-706A；K—O：Ju87B1-706A；P—T：706B；A、F、K和P：四分體時(shí)期；B、G、L和Q：?jiǎn)魏嗽缙冢籆、H、M和R：?jiǎn)魏送砥冢籇、I、N和S：二核期；E、J、O和T：三核期。E：表皮層；En：內(nèi)皮層；ML：中層；T：絨氈層；Tds：四分體；Msp：小孢子。在單核晚期，保持系的絨氈層啟動(dòng)了細(xì)胞程序化死亡，絨氈層邊界模糊，并且能夠明顯地觀察到未退化的細(xì)胞核碎片及較多的細(xì)胞質(zhì)殘留；不育系在單核晚期時(shí)期并沒有觀察到絨氈層的退化，且排列緊密，結(jié)構(gòu)完整。二核期和三核期，保持系的絨氈層完全降解；不育系絨氈層細(xì)胞在二核期開始降解，導(dǎo)致了絨氈層PCD的延遲啟動(dòng)。標(biāo)尺為50 mm

2.4 花藥絨氈層PCD檢測(cè)

為驗(yàn)證D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥花藥發(fā)育過程中絨氈層PCD的異常過程，對(duì)所有材料不同時(shí)期的花藥絨氈層內(nèi)細(xì)胞核的DNA片段化程度進(jìn)行了DNA ladder分析。結(jié)果顯示，保持系706B在單核早期開始產(chǎn)生了大量以140 bp倍增的DNA片段啟動(dòng)PCD，然而3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥均在單核晚期才發(fā)生DNA損傷，進(jìn)一步證實(shí)了絨氈層PCD的延遲啟動(dòng)（圖5）。因此，通過DNA ladder的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)小麥花藥絨氈層呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞程序化死亡特征，并且3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥凋亡的啟動(dòng)時(shí)間明顯延遲于706B。與細(xì)胞學(xué)不同，花藥絨氈層的DNA損傷要比形態(tài)學(xué)特征早一個(gè)時(shí)期，即當(dāng)DNA發(fā)生片段化后，即啟動(dòng)了花藥絨氈層的PCD，最終導(dǎo)致花藥絨氈層細(xì)胞的表型異常。

2.5 活性氧（ROS）含量的測(cè)定

為進(jìn)一步探究D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥絨氈層異常延遲細(xì)胞程序化死亡與活性氧代謝的關(guān)系，對(duì)3種D2型細(xì)胞質(zhì)小麥雄性不育系和其同型保持系在不同時(shí)期花藥中O2-、H2O2和MDA含量的測(cè)定（圖6）。發(fā)現(xiàn)在所有不育系的花藥內(nèi)作為活性氧源頭的超氧陰離子自由基O2-的含量和O2-的衍生物H2O2的含量均在單核晚期達(dá)到峰值。并在此時(shí)期，不育系的O2-和H2O2含量均顯著高于706B（＜0.05）。說明過度積累的活性氧使得花藥內(nèi)細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)降解為小分子物質(zhì)MDA，因此，不育系花藥的MDA含量從單核晚期開始明顯高于706B，在后2個(gè)時(shí)期，所有不育系與保持系有顯著差異（＜0.05）。說明絨氈層延遲啟動(dòng)PCD導(dǎo)致活性氧的過量積累，多余的ROS作為一個(gè)信號(hào)，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而可能造成絨氈層延遲降解的表型特征，最終導(dǎo)致了D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的敗育。

M：Marker D2000；1：四分體時(shí)期；2：?jiǎn)魏嗽缙冢?：?jiǎn)魏送砥冢?：二核期；5：三核期

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.6 抗氧化酶活性的測(cè)定

試驗(yàn)測(cè)定了3種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)保持系5個(gè)時(shí)期花藥SOD、CAT、POD、APX和GPX酶的活性（圖7）。所有不育系SOD、CAT和POD酶活均比保持系高，單核晚期時(shí)與保持系之間差異顯著（＜0.05）。但是，在四分體和單核早期時(shí)，保持系的APX酶活性比3種不育系低。706B的GPX酶活性整個(gè)過程持續(xù)升高，直至三核期酶活性達(dá)到最高。所有不育系的GPX酶活性均呈現(xiàn)先下降后升高的態(tài)勢(shì)。另外，保持系706B的GPX酶活在單核晚期分別高出3種不育系152%、261%和57%。說明抗氧化酶活性的增加，同樣反映了在小麥雄性不育系內(nèi)的ROS的過度積累，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，最終影響了小麥的雄性不育。

2.7 非酶促抗氧化物質(zhì)含量的測(cè)定

通過對(duì)小麥花藥發(fā)育過程中AsA和GSH的含量變化的檢測(cè)（圖8），3種不育系的AsA含量在單核晚期低于保持系且與保持系706B差異極顯著（＜0.01）。保持系706B的GSH含量先顯著升高，然后連續(xù)降低，單核晚期最高。不育系Va87B1-706A的GSH含量變化趨勢(shì)與保持系不同，表現(xiàn)為先降后升，直至三核期達(dá)到最高。而C687B1-706A和Ju87B1-706A的GSH含量先升后降再升，且在三核期達(dá)到最高。在花藥發(fā)育的單核晚期，保持系706B的GSH含極顯著高于所有細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（＜0.01）。說明花藥發(fā)育過程中AsA和GSH的含量劇烈變化，從而導(dǎo)致花粉敗育。

2.8 D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)分析

為研究相關(guān)抗氧化酶基因、和的表達(dá)模式以及與花藥絨氈層PCD的關(guān)系，對(duì)小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花藥、和進(jìn)行半定量和定量分析（圖9和圖10，電子附圖1）。其中，熒光定量以保持系706B四分體時(shí)期花藥中的基因相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照。結(jié)果表明，3種不育系在花藥發(fā)育的各個(gè)階段的表達(dá)量均高于保持系706B。除了Ju87B1-706A，不育系Va87B1-706A、C687B1-706A和保持系706B的表達(dá)水平與酶活性的變化基本相同。隨著花藥的發(fā)育，保持系706B的表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，但是與酶活性的變化有很大的區(qū)別。表達(dá)水平在706B上表現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢(shì)。在四分體和單核早期，3種不育系的表達(dá)水平比保持系高。在二核和三核時(shí)期，不育系中的表達(dá)卻明顯比保持系低。

從以上結(jié)果可以推斷，由于不育系花藥內(nèi)的活性氧在單核晚期的大量累積，防御系統(tǒng)為保護(hù)植物，SOD、CAT和POD酶活顯著上調(diào)，而POD的上升又會(huì)導(dǎo)致IAA的虧損，物質(zhì)運(yùn)輸嚴(yán)重受阻。APX和GPX酶的活性以及非酶抗氧化物質(zhì)AsA和GSH含量的嚴(yán)重下調(diào)又使抗氧化防御系統(tǒng)更加薄弱，使活性氧進(jìn)一步積累。而單核晚期ROS和抗氧化系統(tǒng)異常的變化以及相關(guān)酶基因的異常表達(dá)均與花藥絨氈層紊亂的表型特征表現(xiàn)一致。

3 討論

雜種優(yōu)勢(shì)被認(rèn)為是提高作物產(chǎn)量的最有效途徑，高等植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育在作物雜種利用上具有極其重要的價(jià)值，并在經(jīng)濟(jì)上為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了巨大利益[37]。作為細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的重要胞質(zhì)來源的D2型細(xì)胞質(zhì)具有十分重大的應(yīng)用價(jià)值[8]。本研究利用3種具有完全相同細(xì)胞核的不育系，消除核背景的影響，更加詳細(xì)客觀地進(jìn)行比較。因此，該三種不育系和相應(yīng)保持系是研究質(zhì)核互作和花粉發(fā)育的一套理想材料。而雄性不育小麥敗育的過程往往伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化和細(xì)胞的程序性死亡[16]。由于不同植物不育的遺傳基礎(chǔ)不同，因而花粉敗育的時(shí)期和形式也有所不同[38-41]。對(duì)于具有（D2型細(xì)胞質(zhì)）細(xì)胞質(zhì)的異質(zhì)小麥在長(zhǎng)日照條件時(shí)雄蕊發(fā)生了心皮化，進(jìn)而導(dǎo)致了花粉的敗育利用[42]。Murai等[43]也報(bào)道了具有細(xì)胞質(zhì)的雄性不育小麥也表現(xiàn)出由雄蕊心皮化引起的完全雄性不育。然而，本研究通過對(duì)3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)分析并未發(fā)現(xiàn)雄蕊心皮化的發(fā)生，且進(jìn)一步通過掃描電鏡、體式鏡和絨氈層甲苯胺藍(lán)染色詳細(xì)地觀察發(fā)現(xiàn)花藥的敗育形式為表皮皺縮、細(xì)胞無規(guī)則排列、花藥不開裂且沒有花粉散出的敗育特征。并由DAPI染色和石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥敗育的關(guān)鍵時(shí)期是單核晚期，細(xì)胞學(xué)特征表現(xiàn)為小孢子的異常皺縮和絨氈層的延遲降解，且敗育特征穩(wěn)定。造成這種差異的原因可能是核親本不同，質(zhì)核組合不同，地理環(huán)境的影響以及溫度日照時(shí)間不同而引起的。由于植物雄性不育是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是多種因素共同協(xié)調(diào)導(dǎo)致的現(xiàn)象，所以造成這種差異的原因還有待更系統(tǒng)更全面的研究。同時(shí)，本研究拓寬了D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的敗育類型，為進(jìn)一步研究D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的細(xì)胞學(xué)特征提供了借鑒。

圖7 不育系和保持系花藥各時(shí)期抗氧化酶活性

圖8 不育系和保持系花藥各時(shí)期AsA和GSH的含量

M: Marker D2000; 1: Va87B1-706A; 2: C687B1-706A; 3: Ju87B1 i-706A; 4: 706B

大量學(xué)者表明花藥絨氈層的降解是一種典型的細(xì)胞程序化死亡過程，其PCD表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)的濃縮、畸形，最終解體[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)，不育系在單核晚期PCD的延遲啟動(dòng)可能是導(dǎo)致敗育的細(xì)胞學(xué)原因。那么，關(guān)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥花粉和小孢子的敗育及細(xì)胞程序化死亡的原因，許多研究表明與活性氧的過量積累和相關(guān)抗氧化酶活性相關(guān)[46]。Li等[47]證實(shí)了紅蓮型水稻減數(shù)分裂時(shí)期的PCD異常與ROS的過量積累有關(guān)。也有研究表明WA352在絨氈層的積累，同時(shí)與具有清除ROS作用的COXII共同作用，能夠提前啟動(dòng)植物的PCD過程[48]。本研究發(fā)現(xiàn)在單核晚期不育系活性氧過量累積并與保持系有顯著差異。在花藥整個(gè)發(fā)育過程中，所有不育系的SOD和POD活性均比保持系高，在單核晚期與706B有顯著差異。POD在細(xì)胞的活性氧代謝中有重要作用，能夠維持細(xì)胞內(nèi)源庫(kù)的平衡。POD酶活性的升高使細(xì)胞內(nèi)代謝水平更加旺盛，IAA嚴(yán)重下調(diào)，造成雄性不育[49-50]。706B中CAT酶活呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而不育系中的CAT酶活卻逐漸下降。這種結(jié)果勢(shì)必使活性氧產(chǎn)生的速率加快，丙二醛大量積累，最終使花粉及絨氈層的發(fā)育受阻[51]。所有不育小麥的APX酶活在二核期和706B有顯著差異，而GPX酶活在單核晚期與706B有顯著差異。除Ju87B1-706A外，所有不育系A(chǔ)sA和GSH的含量在單核晚期均極顯著低于保持系，且與鄧明華[52]的研究結(jié)果一致。因此，進(jìn)一步明確了D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥敗育的關(guān)鍵時(shí)期是單核晚期。在此關(guān)鍵期，一方面細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的ROS含量顯著升高；另一方面APX與GPX酶活性以及非酶物質(zhì)含量的持續(xù)降低，說明不育系ROS的清除能力降低，單核晚期抗氧化防御系統(tǒng)薄弱，最終造成植物體內(nèi)活性氧代謝異常。從而推斷延遲啟動(dòng)絨氈層的導(dǎo)致ROS的過量積累，在抗氧化系統(tǒng)薄弱的影響下，導(dǎo)致了敗育的產(chǎn)生。

圖10 不育系和保持系花藥抗氧化酶基因的qRT-PCR分析

隨著對(duì)mtDNA探索的不斷深入，目前，越來越多的研究更注重于分子水平研究植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育。周瑋等[53]研究表明表達(dá)量高的煙草均能更好的適應(yīng)各種處理。李莉等[3]發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期FBA及Mn-SOD酶活變化與基因表達(dá)水平相符，可能直接或間接地造成了小麥的敗育。Noreen等[32]通過提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因而提高棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的育性。Lim等[54]將和轉(zhuǎn)入甘薯葉綠體中得到的轉(zhuǎn)基因植株APX活性與對(duì)照有顯著差異。本研究通過對(duì)3種D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)分析，除了表達(dá)水平與酶活不相符外，、在不育系和保持系花藥中的表達(dá)水平與酶活性變化是一致的。差異的原因可能是CAT家族其他基因的表達(dá)對(duì)該基因有掩蓋作用[55]。本研究在分子生物學(xué)水平揭示了D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的敗育機(jī)理，推測(cè)PCD的延遲啟動(dòng)導(dǎo)致活性氧在敗育關(guān)鍵時(shí)期的過量積累，誘導(dǎo)抗氧化酶基因的異常表達(dá)，從而使抗氧化系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而造成了花藥絨氈層的延遲降解，從而引起D2型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的敗育。此研究為探索詳細(xì)的分子不育機(jī)理提供了理論依據(jù)，更為植物PCD的研究增添了新的內(nèi)涵。

4 結(jié)論

3種同核異質(zhì)D2型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的花粉敗育關(guān)鍵期均在單核晚期，在此關(guān)鍵時(shí)期，小孢子表皮的皺縮萌發(fā)孔的閉合以及絨氈層細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷延遲至單核晚期的現(xiàn)象導(dǎo)致了活性氧的異常積累，膜脂過氧化加劇，抗氧化代謝異常，以及不育系清除活性氧能力的降低，進(jìn)而造成絨氈層細(xì)胞紊亂的表型特征，使不育系花藥內(nèi)花粉母細(xì)胞自單核晚期因不能滿足必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量而出現(xiàn)畸形的異常表現(xiàn)，最終導(dǎo)致敗育。

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（責(zé)任編輯 李莉）

附表1 相關(guān)抗氧化基因熒光定量PCR引物

Table S1 Primers used for fluorescent quantitative PCR assays of antioxidant genes related to CMS

引物Primer序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm(℃) SOD-fSOD-rAGAACCTCAAGCCTATCAGCGACAAATCACGCAAGCACT60 CAT-fCAT-rTGCCTGTGTTTTTTATCCGAACCGTCCATGTGCCTGTAGT62 APX-fAPX-rGTTCATCCCTGGAAGACGCAGAGGGTCACGAGTCCA64 Actin-fActin-rCTCCCTCACAACAACCGCTACCAGGAACTTCCATACCAAC62

1：四分體時(shí)期；2：?jiǎn)魏嗽缙冢?：?jiǎn)魏送砥冢?：二核期；5：三核期

M: Marker D2000; 1: Tetrad stage; 2: Early uninucleate stage; 3: Late uninucleate stage; 4: Binucleate stage; 5: Trinucleate stage

附圖1 不育系和保持系、、和的RT-PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果

Supplemental Fig. 1andgenes PCR amplification of cDNA sequences in anthers fromIAMSLs during different development stages

Tapetal Programmed Cell Death, Antioxidant Response and Oxidative Stress in Wheat Anthers Associated withD2-type Cytoplasmic Male-sterility

LIU ZiHan, SHI XiaoYi, YAN PengJiao, DUAN Yang, GENG XingXia, YE JiaLi, LI Sha, YANG XueTong, ZHANG GaoMing, JIA YuLin, ZHANG LingLi, SONG XiYue

(College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

D2type cytoplasm is the considerable source of cytoplasm of cytoplasmic male sterility (CMS). It is of great value to further study the cytological characteristics and mechanism of physiology and molecules in heterologous cytoplasmic male sterility (CMS) wheat for the heterosis utilization.To elucidate the abortive cytological characteristics of D2-type cytoplasmic male-sterility, the phenotypes of anthers, microspores, tapetum were analyzed by scanning electron microscope, DAPI staining, and paraffin section, as well as detectingtapetal apoptotic DNA fragmentation by DNA ladder. To further clarify that the D2-type cytoplasmic male-sterility is associated with abnormal tapetal programmed cell death and reactive oxygen species metabolism, the physiological properties, including the contents of reactive oxygen species (ROS), activities of ROS-scavenging enzymes (superoxide dismutase (SOD), peroxidase, catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), and glutathione peroxidase (GPX)) and nonenzymatic antioxidants (ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH)), and the expression levels of antioxidant-associated genes from three D2-types of cytoplasmic male sterile lines (Va87B1-706A, C687B1-706A, Ju87B1-706A) and the maintainer 706B of wheat were compared.Compared with the maintainer line, at the trinucleate stage, the inner epidermal cells of D2-type cytoplasmic male-sterility accumulated less and more unconsolidated Ubisch bodies and the epidermis of microspores were extremely scabrous. The abortive pivotal period of pollen was initiated at the later uninucleate stage, which the delayed degradation of tapetum and abnormal structure of the microspore were related to the serious oxidative stress, disorganized activities of antioxidant enzymes, down-regulated contents of non-enzymatic antioxidants and significant difference of the expression level of some related enzyme genes in the three D2-types of cytoplasmic male sterile lines. Additionally, the expression level ofandgenes was approximated to the activities of enzymes. However, there existed a distinct difference between the expression level ofgene and the activities of enzymes resulting from multiple-gene encodinggene.It was deduced that delay of start-up of the tapetal PCD (Programmed Cell Death) results from excessive ROS accumulation, and then destroyed the balance of the antioxidant defense system, and eventually led to the abortion of D2-types of cytoplasmic male sterile lines. Therefore, in order to further explore the abortive mechanism of cytoplasmic male sterility (CMS) wheat, this study provided an important theoretical basis and application significance.

wheat (L.); D2-types cytoplasmic male sterility; tapetal programmed cell death; ROS metabolism; gene expression

2017-04-10；接受日期：2017-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271792）

劉子涵，E-mail：liuzihan643@163.com。通信作者宋喜悅，E-mail：songxiyue@126.com