結直腸癌組織中COX-2、MLVD的表達變化及意義

曾永慶，朱廣玉，文 剛，涂從銀

(安徽醫科大學第三附屬醫院，合肥230061)

淋巴轉移是結直腸癌主要轉移方式，也是判斷腫瘤TNM分期、復發及預后的重要因素。血管內皮細胞生長因子(VEGF)-C/VEGF-D-VEGFR-3信號轉導途徑該途徑是研究最多和最成熟的信號轉導途徑，目前已經確定該信號通路在腫瘤的淋巴管生成中起關鍵作用［1］。研究表明環氧化酶-2(COX-2)在胃癌、小細胞肺癌中能夠通過上調VEGF-C從而在腫瘤淋巴結轉移中發揮作用［2］。近期我們通過檢測環氧化酶-2(COX-2)在結直腸癌組織中的表達探討其在腫瘤淋巴轉移中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集安徽醫科大學第三附屬醫院胃腸外科2008～2010年手術切除并經術后病理證實的結直腸癌標本50例(實驗組)，其中直腸癌30例，結腸癌20例。50例患者中，男35例，女15例，男女比為2.4∶1;年齡32 ～88 歲，平均60.5 歲;Ⅰ ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期32例;高、中分化36例，低分化14例;有淋巴結轉移者28例，無淋巴結轉移者22例。術前均未行放化療。另取相應癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)50例作為對照組。

1.2 COX-2、微淋巴管密度(MLVD)的檢測方法①主要試劑:兔抗人COX-2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗人D2-40單克隆抗體原液、免疫組化SP通用型試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、多聚賴氨酸、檸檬酸組織抗原修復液粉劑、PBS粉劑、EDTA粉劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。②染色方法:采用免疫組化SP法染色，按試劑盒說明書操作。用COX-2抗體檢測組織中COX-2的表達;用D2-40單克隆抗體標記上述組織MLVD。③結果判斷:COX-2陽性表達主要在細胞質或細胞膜，表現為黃色或者棕黃色顆粒。采用Image Pro Plus分析軟件測量染色部分的累積光密度(IOD)，其代表COX-2表達量。采用Weidner等［3］方法加以改進，由病理科醫師協助，D2-40陽性染色為棕黃色顆粒狀，定位于淋巴管內皮細胞胞膜和胞質，形態上陽性脈管符合淋巴管的特征。觀察4個高倍視野(×200)的微淋巴管數目，取均值作為MLVD。

1.3 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件。計量資料符合正態分布時的組間比較采用t檢驗;計數資料比較用χ2檢驗，COX-2與MLVD的相關性分析采用Pearson相關分析法。α=0.05。

2 結果

2.1 結直腸癌兩組中COX-2、MLVD的表達變化實驗組中COX-2的 IOD為77 485.24±14 007.16，MLVD 為(7.63 ±1.00)條/HP，均顯著高對照組的32 749.76 ±6 152.31 和(0.30 ±0.25)條/HP，兩組相比，P 均 ＜0.01。

2.2 COX-2陽性表達與結直腸癌臨床病理指標的關系 見表1。

2.3 結直腸癌組織中COX-2陽性表達與MLVD的相關性 結直腸癌組織中COX-2的IOD值(77 485.24 ±14 007.16)與 MLVD［(7.63 ±1.00)條/HP］呈正相關(r=0.581，P ＜0.01)，見圖1。

3 討論

目 前，大 量 研 究 表 明［4，5］VEGF-C/VEGF-DVEGFR-3信號轉導通路在腫瘤的淋巴管生成中起關鍵作用。VEGF-C可以誘導淋巴內皮細胞增殖、遷徙，并形成淋巴竇;VEGF-D與多種腫瘤的發生發展有關;VEGFR-3在胚胎期于靜脈和淋巴內皮上表達，成年期只限于淋巴內皮細胞，僅與VEGF-C和VEGF-D相結合，主要參與淋巴內皮細胞增殖。當VEGF-C與VEGF-D結合并激活位于淋巴管內皮細胞膜上的VEGFR-3時，可誘導VEGFR-3酪氨酸磷酸化，通過一系列信號級聯反應導致淋巴管生成、增生、擴張，促進腫瘤細胞淋巴道轉移。COX-2是誘導型酶，除參與炎性反應外，還參與多種腫瘤細胞增生、抗凋亡、促進血管生成過程，促進腫瘤的浸潤和轉移。張彬等［6］證實胃癌組織中COX-2呈高表達，與胃癌新生淋巴管的生成、胃癌淋巴結轉移、臨床TNM分期相關;COX-2表達上調與VEGF-C表達呈正相關，提示兩者在淋巴管形成及胃癌發展中可能起協同作用。亦有學者［7］認為，COX-2是胃癌進展的蛋白標記物之一，且可能作為判斷胃癌預后及治療的重要工具。

表1 COX-2陽性表達與結直腸癌臨床病理指標的關系

圖1 結直腸癌組織中COX-2陽性表達與MLVD的相關性

本研究結果顯示，結直腸癌組織中COX-2表達明顯高于癌旁正常組織，且COX-2的高表達和腫瘤分期、分化程度及有無淋巴結轉移有關，提示COX-2在結直腸癌的發生、發展中起到重要作用。

D2-40又稱癌胚抗原M2A單克隆抗體，只存在于淋巴管內皮細胞上，對淋巴內皮具有很強的特異性和敏感性，是理想的淋巴管內皮標記物［8］。本研究通過D2-40標記淋巴管來觀察MLVD，結果顯示結直腸癌組織中MLVD的表達顯著高于癌旁組織，表明結直腸癌組織中存在新生淋巴管。

腫瘤進展是一個多因素、較為復雜的調節過程。Sugiura等［9］研究發現 VEGF-C和 VEGF-D在腫瘤淋巴管生成和淋巴轉移中發揮重要作用，且與MLVD有很強的相關性。其與腫瘤淋巴管生成和轉移的關系得到實驗模型的驗證。本研究結果顯示，結直腸癌組織中COX-2的表達與MLVD存在明顯正相關關系，提示COX-2是VEGF-C/VEGF-D-VEGFR-3信號轉導通道的重要上游調節因子，通過該通道影響腫瘤的淋巴管生成，為腫瘤的淋巴結轉移提供可能。這說明惡性腫瘤的浸潤、轉移機制較為復雜，是涉及多種細胞因子、多條信號傳導途徑的過程。明確特殊細胞因子在腫瘤轉移機制中的作用將可能為腫瘤的治療提供新的臨床思路。

［1］朱廣玉，常家聰.惡性腫瘤淋巴轉移分子標記物及轉移機制研究進展［J］.山東醫藥，2010，50(8):107-108.

［2］Su JL，Shih JY，Yen ML，et al.Cyclooxygenase-2 induces EP12 and HER-2/Neudependent vascular endothelial growth factor-C up regulation:a novel mechanism of lymphangiogenesis in lung adeno carcinoma［J］.Cancer Res，2004，64(2):554-564.

［3］Weidner N，Scruple JP，Welch WR，et al.Tumor anglogensis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］.NEJM，1991，324(1):1-8.

［4］Arigami T，Natsugoe S，Uenosono Y，et al.Vascular endothelial growth factor-C and-D expression correlates with lymph node micrometastasis in pN0early gastric cancer［J］.J Surg Oncol，2009，99(3):148-153.

［5］Yan G，Zhou XY，Cai SJ，et al.Lymphangiogenic and angiogenic microvessel density in human primary sporadic colorectal carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2008，14(1):101-107.

［6］張彬，周業江.胃癌中COX-2的表達及其與胃癌淋巴結轉移的關系［J］.實用醫學雜志，2011，27(18):3320-3323.

［7］Almeida PRC，Ferreira FVA，Santos CC，et al.Immunoexpression of cyclooxygenase-2 in primary gastric carcinomas and lymph node metastases［J］.World J Gastroenterol，2012，18(8):778-784.

［8］Kenney BC，Jain D.Identification of lymphatics within the colonic lamina propria in inflammation and neoplasia using the monoclonal antibody D2-40［J］.Yale J Biol Med，2008，81(3):103-113.

［9］Sugiura T，Ionue Y，Matsuki R.VEGF-C and VEGF-D expression is correlated with lymphatic vessel density andlymph node metastasis in oral squamous cell carcinoma:implications for use as aprognostic marker［J］.Int J Oncol，2009，34(1):673-680.