甘薯根腐病病原菌rDNA—ITS區序列分析

雷劍　王連軍　蘇文瑾

摘要：2011年以來，從湖北省甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]主產區采集了根腐病典型植株，分離得到引起甘薯根腐病的病原菌[茄病鐮孢甘薯專化型病菌（Fusarium solani Mart.Sacc.f.sp.batatas McClure，簡稱VSB）]，并對分離得到的甘薯茄病鐮孢甘薯專化型病菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析，測序結果顯示目的片段長度為526 bp。

關鍵詞：甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]；根腐病；病原菌；ITS；序列分析

中圖分類號：S531 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）20-3946-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.037

Abstract： Since 2011， Pathogenic bacteria of sweet potato root rot disease was separated and purified from Hubei province. The pathogenic bacteria of sweet potato root rot disease was identified by molecular method. The results showed that the length of the target fragment was 526 bp.

Key words： sweet potato；root rot disease；pathogenicity；ITS；sequence analysis

甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]具有高產、穩產、適應性廣、抗逆性強、營養豐富、用途廣泛等特點，是中國僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物。甘薯具有良好的適應性、抗逆性、高產性，對中國的糧食安全具有重要保障作用，其不僅營養很豐富，而且具有極強的保健作用。近年來，隨著人民生活水平提高，對食品保健的要求越來越迫切，其發展前景十分廣闊[1-3]。甘薯根腐病是中國北方甘薯區大田常見的一種真菌性病害。隨著薯種調運、南薯北種，長江中下游區域的甘薯根腐病有逐年蔓延趨勢。近年來，在湖北省甘薯主產區均發現了甘薯根腐病的危害，一般田塊發病后減產15%，危害較嚴重的達50%，甚至絕收，對甘薯高產、穩產威脅極大[4-6]。傳統的植物病原鑒定方法主要是通過顯微鏡觀察，確定病原菌的種屬，但是同一病害的病原菌還存在生理小種，在分子水平上才能檢測到差異。分子生物學的發展及革命性的變化，使得這種差異得以檢測，分子水平檢測手段相對于傳統鑒定方法，準確性得到極大提高。而以真菌的核糖體基因轉錄間隔區為靶序列的分子水平檢測技術成為研究熱點[7]。本研究通過分離純化根腐病病原菌為樣本，以真菌核糖體基因轉錄間隔區為靶標，采用通用引物獲得根腐病病原菌的目標片段，為指導該地區根腐病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘薯根腐病病原菌菌株為2011～2014年在湖北省采集的甘薯根腐病典型病株，分離純化得到病原菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離病原菌 將采集到的甘薯根腐病典型病株清洗干凈，用剪刀剪取病健交界處的莖段約0.5 cm，剝去甘薯莖段的外皮清洗干凈，然后將莖段放置于超凈工作臺。用消毒過的刀片切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，然后將切好的小塊放入75%的乙醇溶液中消毒3 min，再轉移至5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，隨后取出浸泡好的小塊用無菌水沖洗3次，用滅過菌的濾紙吸干小塊上的水分，最后接種在PDA固體培養基上，放置于28 ℃的恒溫培養箱中培養，觀察有無菌絲出現[8]。

1.2.2 病原菌純化培養 當發現病原菌的菌絲長出時，在超凈工作臺上用滅過菌的挑菌針挑取病原菌的菌絲體，轉移至滅菌的PDA培養基上，28 ℃恒溫培養箱中培養，觀察有無其他雜菌產生。如果PDA培養基上還有其他雜菌，則繼續重復上述的操作，直至PDA培養基中僅有根腐病一種病原菌菌絲。

1.2.3 病原菌形態學觀察 在載玻片上滴一滴乳酸棉蘭染色劑，再用接種針挑取菌絲，分散于染色液中，蓋上蓋玻片放置2 min后，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 病原菌基因組DNA的提取 將純化好的供試根腐病病原菌在PDA培養基上培養1周后收集病原菌的菌絲體，采用CTAB法提取和純化甘薯根腐病病原菌基因組DNA，置于-20 ℃保存備用。

1.2.5 擴增引物 采用真菌核糖體基因轉錄間隔區的通用引物ITS1和ITS4對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，引物ITS1序列：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；引物ITS4序列：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2.6 PCR擴增反應 甘薯根腐病病原菌核糖體基因轉錄間隔區PCR擴增反應總體積為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，10 ng/μL 模板DNA 3 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，36個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增完畢后，擴增產物分別加入適量上樣緩沖液[20%（W/V，g/mL）Ficoll-400，0.25%（W/V，g/mL）溴酚藍，0.25%（W/V，g/mL）二甲苯青]，以1.5%瓊脂糖膠分離，電泳緩沖液為1×TAE。電泳時功率恒定為70 W，電泳1.5～2.0 h，電泳完畢后，利用凝膠成像分析系統UVI Photo觀察并拍照記錄。endprint

1.2.7 PCR產物的克隆和測序 使用UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒（上海生物工程技術服務有限公司）回收特異性PCR片段，并參照試劑盒說明書進行操作。使用pMD 18-T載體（帶Amp抗性）[寶生物工程（大連）有限公司]克隆特異PCR片段，并參照試劑盒說明書進行連接。大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備參照《分子克隆》（第三版）中試驗指南進行操作[9]。隨機選擇6個在IPTG/X-gal平板上生長的菌落，分別用牙簽或無菌槍頭挑至含有50 mg/L Amp的50 mL LB液體培養基中，37 ℃下200～250 r/min振蕩培養過夜，抽提質粒DNA，用PCR擴增及BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定是否含有特異目的片段。PCR擴增片段送至上海基康生物技術有限公司進行測序。

1.2.8 rDNA-ITS區序列分析 將分離所得根腐病菌株的rDNA-ITS區序列用DNAMAN軟件分析，序列同源性檢索在NCBI（National Center for Biotechnology Information）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），利用BLAST（Basic local alignment search tool）序列比較工具進行分析。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取

從甘薯根腐病病原菌中提取的基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。結果表明，基因組DNA的提取量、純度和完整性較好，適用于進一步的研究。

2.2 甘薯根腐病病原菌核糖體DNA-ITS區序列PCR擴增

利用通用引物 ITS1/ITS4對甘薯根腐病病原菌核糖DNA模板進行PCR擴增。由圖2可以看出，目的片段與預期目的片段長度基本一致，并對分離到的真菌核糖體基因轉錄間隔區進行測序分析。目的片段長度為526 bp，確定分離得到的病原菌就是引起湖北地區甘薯根腐病發病的真菌。

3 小結與討論

植物病原真菌的分類鑒定主要依據其營養體和子實體的形態特征，但由于形態特征容易受到培養條件和其他因素的影響，而且許多子實體類型經常難以獲得，給鑒定工作帶來困難。真菌DNA的堿基組成遺傳穩定，不易受環境影響，而且在生活史任何階段均可獲得。ITS區域在不同菌株間存在豐富的變異，對ITS區域進行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS序列信息，為病原菌的分類鑒定及系統發育等研究提供了重要依據，而且為建立病原菌的分子監測與疫病的快速診斷技術奠定了基礎[10]。

參考文獻：

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[8] SCHAAD N W，BRENNER D. A bacterial wilt and root rot of sweet potato caused by Erwinia chrysanthemi[J].Phytopathology，1977，67：302-308.

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[10] 李凌燕，肖海峻，王偉青，等.北京大興區甘薯根腐病原菌的分離及分子鑒定[J].生物技術進展，2016，6（1）：67-70.endprint