一例松鼠猴感染乳酸明串珠菌的診斷報告

張志忠 王 瑞 聶 睿 郭 浩 殷冬冬 王桂軍

(1.合肥野生動物園，合肥，230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥，230036)

一例松鼠猴感染乳酸明串珠菌的診斷報告

張志忠1王 瑞2聶 睿2郭 浩2殷冬冬2王桂軍2

(1.合肥野生動物園，合肥，230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥，230036)

2014年9月，合肥野生動物園發(fā)生一起松鼠猴感染乳酸明串珠菌的病例。病猴出現(xiàn)咳嗽，流鼻涕，發(fā)熱等癥狀。病程較快，觀察到上述癥狀后即死亡。剖檢時發(fā)現(xiàn)肺臟瘀血，腸壁有大小均一的黑點。從病死猴的肝臟分離到一株細(xì)菌，純分后發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)為細(xì)小灰白色，表面光滑，呈透鏡狀，邊緣整齊無皺褶。革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陽性球菌，經(jīng)過細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增和測序比對，確診為乳酸明串珠菌感染。

松鼠猴；乳酸明串珠菌；感染

乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)屬于鏈球菌科(Streptococcaceae)，明串珠菌屬，存在于植物表面，常用于青貯、泡菜和果酒中。一般認(rèn)為乳酸明串珠菌對人和動物沒有致病性[1]。但自1984年，Shlaes 等首次證實明串珠菌為條件致病菌，可導(dǎo)致人類的感染，此后陸續(xù)有明串珠菌導(dǎo)致人感染的報道[2]，但國內(nèi)很少有動物感染乳酸明串珠菌的報道。2014年9月合肥野生動物園松鼠猴(Saimirisciureus)出現(xiàn)死亡，另發(fā)現(xiàn)一些松鼠猴出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕等癥狀，臨床觀察和病理變化并結(jié)合實驗室診斷，確診為乳酸明串珠菌感染?，F(xiàn)將該病例的診斷情況報告如下。

1 材料和方法

1.1 病料來源

合肥野生動物園病死松鼠猴。

1.2 主要試劑和引物

DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、dNTPs、ddH2O、EB等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，16S rRNA引物分別為：16SF(5’-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3’)，16SR(5’-CTACGGCTACCCTGTTACGA-3’)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

1.3.1 細(xì)菌分離與純化

無菌操作取病死猴肝臟、脾臟、肺臟接種于血液瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于輔酶培養(yǎng)基，37℃條件下，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌染色鏡檢

挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.3 細(xì)菌DNA的提取

挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)18 h，從菌液中提取細(xì)菌DNA。

1.3.4 細(xì)菌16S rRNA的序列測定與分析

以提取的DNA樣本作為模板，使用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，分別含TaqMix12.5 μL，模板5 μL，上下游引物各1 μL，加水補足至25 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸2 min，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 藥敏試驗

采用紙片法，按照試劑使用說明書進(jìn)行藥敏試驗。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟瘀血(圖1)，腸壁有大小均一的黑點(圖2)。

2.2 細(xì)菌純化與鏡檢結(jié)果

細(xì)菌純化培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)菌落為灰白色細(xì)小菌落，表面光滑呈透鏡狀，邊緣整齊無皺褶。挑取菌落涂片，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)為G+球菌，呈長鏈狀排列，似乳桿菌(圖3)。

圖1 肺臟瘀血Fig.1 Lung congestion

圖2 腸壁有大小均一的黑點Fig 2 Black spots of uniform size on intestinal wall

圖3 顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)(×1 000)Fig.3 Microscopic morphology of bacteria(×1 000)

2.3 細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果

細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見長度約為1 500 bp的特異條帶，與預(yù)期條帶大小相符合(圖4)。

2.4 序列分析結(jié)果

將所得菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性比較，結(jié)果與Leuconostoclactisqz-253(乳酸明串珠菌qz-253株，登錄號：AB904777.1)等乳酸明串珠菌的基因同源性達(dá)93%，據(jù)此，該病例可確診為乳酸明串珠菌感染。

PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果如下：

圖4 細(xì)菌16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophorogram of bacterial 16S rRNA PCR products注：M.DNA Maker DL2 000；1.細(xì)菌PCR產(chǎn)物 Note：M.DNA Maker DL2 000；1.bacterial PCR products

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明乳酸明串珠菌對先鋒4號，先鋒5號、頭孢呋辛、左氧氟沙星、頭孢噻肟、青霉素、復(fù)方新諾明、大觀霉素、氨芐西林高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素中度敏感；對萬古霉素耐藥。

3 討論

自Buu-Ho?等于1985年首次報道第一例人感染腸膜明串珠菌起[3]，國內(nèi)外陸續(xù)報道過明串珠菌相關(guān)感染病例，如明串珠菌致敗血癥并發(fā)腦膿腫[4]；明串珠菌致感染性休克[5]等。在2014年翁繩鳳等報道了國內(nèi)一例人感染乳酸明串珠菌的報道，患者的臨床癥狀大致相同，存在高熱、咳嗽等癥狀且相關(guān)研究表明，明串珠菌的感染情況常發(fā)生于使用萬古霉素治療感染時期，以及機(jī)體免疫能力低下的時期[6]。而在動物中尚未見到乳酸明串珠菌感染的報道。此次合肥野生動物園發(fā)生松鼠猴感染乳酸明串珠菌，說明乳酸明串珠菌對動物也可能存在感染力。目前，國內(nèi)外尚無乳酸明串珠菌感染后應(yīng)用抗菌藥物治療的標(biāo)準(zhǔn)。乳酸明串珠菌感染后的治療多是根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)來選擇用藥方案[7]。針對此次松鼠猴感染乳酸明串珠菌，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果用藥，同時在用藥過程中要嚴(yán)密監(jiān)控猴群的情況，發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)及時查找原因，調(diào)整治療方案。另一方面，要做好動物園動物衛(wèi)生防疫工作，改善動物的飼養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)，并切實完善飼養(yǎng)環(huán)境的定期消毒制度等。

[1] Buchanan R E，Gibbons N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學(xué)出版社，1984：702-705.

[2] Shlaes D M，Marino J，Jacobs M R.Infection caused by vancomycin resistantStreptococcussanguisⅡ[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1984，25(4)：527-528．

[3] Buu-Ho? A，Branger C，Acar J F.Vancomycin-resistant streptococci orLeuconostocsp.[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1985，28(3)：458-460.

[4] 韋義軍，龍?zhí)O.明串珠菌敗血癥并發(fā)腦膿腫一例[J].中華兒科雜志，2007，45(10)：768-769.

[5] 鮑文韜，孫建玲，于亮.明串珠菌致感染性休克一例并相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].中華實驗和臨床感染病雜志：電子版，2012，6(5)：469-470.

[6] 翁繩鳳，康麗軍.腸膜明串珠菌血流感染1例[J].中國感染控制雜志，2014，13(2)：123-125.

[7] 尹秀云，陳建魁，牟兆欽，等.明串珠菌所致菌血癥報告一例報告[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2001，25(3)：239-240.

LeuconostoclactisInfection in Captive Squirrel Monkeys

Zhang Zhizhong1Wang Rui2Nie Rui2Guo Hao2Yin Dongdong2Wang Guijun2

(1.Hefei Wildlife Park，Hefei，230031，China；2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei，230036，China)

In September 2014，Leuconostoclactisinfection was found in squirrel monkeys at the Hefei Wildlife Park.Sick monkeys showed symptoms of cough，runny nose，and fever.The course of the infection was short and monkeys died quickly after these symptoms were observed.At necropsy，we found lung congestion and uniform-sized black spots on the intestinal wall.After screening and purifying bacteria isolated from the liver of dead monkeys，we found the pure colony was small，gray white，smooth-faced，lens shaped and with neat edges.Gram positive cocci were confirmed by microscopic examination after Gram staining.After bacterial 16S rRNA PCR amplification，sequencing and sequence alignment，the pathogen was confirmed to beLeuconostoclactis.

Squirrel monkey；Leuconostoclactis；Infection

稿件運行過程

2017-01-11

修回日期：2017-02-27

發(fā)表日期：2017-08-10

S858.9

A

2310-1490(2017)03-494-04

張志忠，男，44歲，高級獸醫(yī)師；主要從事野生動物飼養(yǎng)管理和獸醫(yī)研究。E-mail：1471197690@qq.com