低溫馴化對東北林蛙過冷卻點及結冰點的影響

楊 斌 袁一田 陳 晨 肖向紅 黃璞祎 柴龍會

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

低溫馴化對東北林蛙過冷卻點及結冰點的影響

楊 斌 袁一田 陳 晨 肖向紅 黃璞祎 柴龍會*

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

為評價東北林蛙(Ranadybowskii)的耐寒性及其適應低溫能力，并為其養(yǎng)殖、運輸和暫養(yǎng)提供參考數(shù)據(jù)，本研究分別測定了25℃、4℃和0℃馴養(yǎng)條件下東北林蛙的過冷卻點和結冰點。結果顯示，東北林蛙過冷卻點最低可達-2.6℃，最高為-1.4℃；結冰點最低可達-2.3℃，最高為-1.2℃；低溫馴化可顯著降低東北林蛙結冰點。基于本試驗結果和相關文獻分析表明，經過低溫馴化的東北林蛙可通過升高血糖維持在-2℃左右的過冷卻狀態(tài)，其耐寒對策為避免冰凍；在東北林蛙的人工養(yǎng)殖越冬、暫養(yǎng)、運輸過程中，應盡量控制在-1℃以上以防凍死或降低其食用品質。

東北林蛙；低溫脅迫；過冷卻點；結冰點

東北林蛙(Ranadybowskii)俗稱蛤士蟆，因其肉質鮮美、營養(yǎng)豐富、雌蛙輸卵管(蛤士蟆油)可入藥，是我國東北地區(qū)重要的經濟蛙類。林蛙養(yǎng)殖業(yè)甚至是我國北方部分地區(qū)的支柱產業(yè)。東北林蛙屬于變溫動物，受亞寒帶寒冷的冬季氣候影響長達5～6個月。東北林蛙可通過冬眠等一系列生理調節(jié)過程增強其抗寒性，以適應寒冷而漫長的冬季。

在昆蟲耐寒性研究中，過冷卻點(supercooling point，SCP)常作為一項重要指標來界定昆蟲的耐寒性強弱[1]。昆蟲過冷卻是指溫度低于昆蟲體液結冰點(freezing point，F(xiàn)P)時，其體液仍能保持液體狀態(tài)的現(xiàn)象[2]。實際上，許多變溫動物，尤其是體重小于60 g的個體，能夠保持過冷卻狀態(tài)[3]。生活在林區(qū)的北方合唱蛙(Pseudacristriseriatamaculata)過冷卻點可達-3℃[4]。本研究擬通過分別測定25℃、4℃和0℃馴養(yǎng)條件下東北林蛙的過冷卻點和結冰點，以期評價東北林蛙的耐寒性及其適應低溫能力，并為其養(yǎng)殖、運輸和儲存提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北林蛙成體于2016年9月采自黑龍江省伊春地區(qū)，雄蛙體重19～21 g，雌蛙體重25～28 g；瑞士Precisa公司電子分析天平；海爾公司控溫冰箱；美國CUSTOM BIOGENIC SYSTEMS公司 2101 Controlled Rate Freezing System程序降溫儀。

1.2 實驗分組及實驗對象準備

將東北林蛙分為25℃組，4℃組、0℃組，均飼養(yǎng)在濕潤的PP塑料盒內，分別置于25℃室溫、4℃控溫冰箱和0℃控溫冰箱。其中4℃組和0℃組分別選取常溫狀態(tài)的東北林蛙，以每天大約降溫1℃的速度，最終將其飼養(yǎng)溫度分別控制在4℃和0℃。每個溫度組隨機選取雌雄各10只、馴養(yǎng)1周后進行實驗。

1.3 過冷卻點及結冰點的測量方法

將程序降溫儀的溫度傳感器金屬探頭通過泄殖腔插入剛剛經過雙毀髓的林蛙體內，并保持溫度傳感器處于其肝臟中心位置。將林蛙放入程序降溫儀的冷凍室內，啟動程序降溫儀，使冷凍室以1℃/min的速率下降并維持在-10℃。隨著程序降溫儀冷凍室溫度下降，其溫度傳感器也記錄到蛙體溫度下降曲線。當蛙體溫度下降到0℃以下某一數(shù)值時，其體液開始形成冰晶而放熱，蛙體溫度又開始突然略微上升，此時相對較低的溫度值即為過冷卻點(SCP)；當蛙體溫度升高并維持在某一數(shù)值一段時間后，體液開始結冰，不再放熱，蛙體溫度值又開始逐漸下降，此時下降之前所對應的溫度值即為結冰點(FP)，試驗結束，保存數(shù)據(jù)(圖1)。

圖1 東北林蛙過冷卻點和結冰點的測量方法Fig.1 The method for measuring SCP and FP of Rana dybowskii

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 20.0.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，用Duncan檢驗法進行均值間多重比較，P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 低溫馴化對東北林蛙過冷卻點(SCP)的影響

東北林蛙過冷卻點最低可達-2.6℃，最高為-1.4℃(表1)。低溫馴化可降低東北林蛙過冷卻點(圖2)。無論是雄性還是雌性東北林蛙，0℃組與25℃組的過冷卻點平均值比較接近，且均低于4℃組平均值。東北林蛙分別在0℃和4℃馴養(yǎng)條件下，同一溫度組內雌雄之間的過冷卻點差異不顯著。

表1 不同馴養(yǎng)溫度條件下東北林蛙的過冷卻點和結冰點(℃，Mean±SD，n=10)

Tab.1 The supercooling points(SCP)，freezing points(FP)of Ranadybowskii domesticated under different temperature conditions

圖2 低溫馴化對東北林蛙過冷卻點(SCP)的影響Fig.2 The effects of domestication by low temperature on SCP of Rana dybowskii 不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05)

2.2 低溫馴化對東北林蛙結冰點(FP)的影響

東北林蛙結冰點最低可達-2.3℃，最高為-1.2℃(表1)。0℃組雌性東北林蛙的結冰點最低，0℃組雄性與4℃組雌性的結冰點也較低，25℃組雌性與雄性的結冰點均為最高，低溫馴化對東北林蛙結冰點有顯著影響(圖3)。東北林蛙分別在0℃和4℃馴養(yǎng)條件下，同一溫度組內雌性的結冰點顯著低于雄性。

圖3 低溫馴化對東北林蛙結冰點(FP)的影響Fig.3 The effects of domestication by low temperature on FP of Rana dybowskii 不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05)

3 結論與討論

變溫脊椎動物適應0℃以下的低溫環(huán)境采用的策略包括避凍對策(避免冰凍，freeze avoidance)和耐凍對策(耐受冰凍，freeze tolerance)[5]。避凍指機體在低溫脅迫下，繼續(xù)維持體內過冷卻狀態(tài)，阻止細胞外液結冰，使之免受凍傷的現(xiàn)象[5-6]。耐凍是指機體在低溫條件下，忍耐細胞外液結冰而不死亡的現(xiàn)象[7]。

我國北方冬季漫長，天氣寒冷，林蛙需要經歷長達5～6個月的冬眠期度過嚴寒的冬季。楊翠軍發(fā)現(xiàn)[8]，東北林蛙于4℃、0℃馴化10 d后，置于-1℃無水潮濕環(huán)境中，10 d后存活率仍可達到100%，置于-2℃無水潮濕環(huán)境中1～5 d，東北林蛙的存活率分別為100%、87%、53%、13%、0%。由此可知，-1℃是東北林蛙能較長時間耐受的低溫，而-2℃是東北林蛙能短時間耐受的極限低溫?；诖耍驹囼炘O置25℃組為對照組，4℃組、0℃組為低溫馴化組。試驗發(fā)現(xiàn)，經過0℃低溫馴化1周后，雄性東北林蛙的過冷卻點和結冰點分別可低至-2.2℃、-1.7℃，雌性的分別可低至-2.4℃、-2.3℃。這意味著東北林蛙體溫低于-2℃，其體液將會結冰，且不能長期存活。由此說明東北林蛙不能忍受冰凍，但能維持過冷卻狀態(tài)，其耐寒對策為避凍對策。

避凍動物降低機體過冷卻點和結冰點通常通過在體內積累滲透壓調節(jié)物質，包括多元醇、糖和某些氨基酸[9-10]。Xiao[11]、李秀峰[12]等發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境溫度降低，東北林蛙血糖水平逐步升高。本試驗發(fā)現(xiàn)，低溫馴化可顯著降低東北林蛙結冰點，其原因可能正是因為其血糖水平升高。

生活在林區(qū)的蛙類其過冷卻點一般高于-3℃，很大程度上是因為擁有潮濕的皮膚[4，13]。而鋤足蟾(Scaphiopusbombifrons)穴居在相對干燥的土壤中避免冰凍，其過冷卻點要更低，大約為-6℃[14]。東北林蛙群居冬眠，最適宜的場所是水深達1.5～2.0 m深水灣冰面下的河底石礫、草根或樹根下，其周圍是0℃以上的安靜、緩慢的水流[15]。因此，東北林蛙過冷卻點和結冰點雖然只有-2℃左右，但足以應對其冬眠棲居環(huán)境的低溫，即使偶爾遭遇0℃左右的低溫也能存活。

本試驗結果還提示，在東北林蛙的人工養(yǎng)殖越冬、暫養(yǎng)、運輸過程中，除了要將其體溫控制在較低溫度下以降低機體代謝率、減少損耗，還應盡量控制在-1℃以上以防凍死或降低其食用品質。

本試驗在測量過冷卻點及結冰點之前，為保障動物福利而將東北林蛙雙毀髓處死后再測量，所得數(shù)值可能與冬眠狀態(tài)下活蛙的稍有差異。

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The Effects of Cold Acclimation on Supercooling Point and Freezing Point ofRanadybowskii

Yang Bin Yuan Yitian Chen Chen Xiao Xianghong Huang Puyi Chai Longhui*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

To evaluate cold tolerance ofRanadybowskiiand its ability to adapt to low temperature，and provide reference data for the breeding，transportation and temporary rearing，we measured the supercooling point and freezing point of farm-rearedRanadybowskiiat 25℃，4℃ and 0℃.The results showed that the minimum supercooling point ofRanadybowskiicould reach-2.6℃，the highest was-1.4℃，and the freezing point could be as low as-2.3℃，the highest was-1.2℃，while cold acclimation could significantly reduce the freezing point.Based on our experimental results and review of literature we conclude that cold acclimatedRanadybowskiican maintain a metastable state of supercooling at about-2℃ by increasing blood sugar and belongs to the freeze-avoiding species.For artificial breeding ofRanadybowskiiin winter，temporary rearing and transport，the temperature should be above-1℃ for freeze avoidance and high-quality food should be prvoded.

Ranadybowskii；Low temperature stress；Supercooling point；Freezing point

稿件運行過程

2017-03-01

修回日期：2017-04-19

發(fā)表日期：2017-08-10

Q955

A

2310-1490(2017)03-487-04

國家級大學生創(chuàng)新訓練項目(201510225085)；國家自然科學基金項目(31672309)

楊斌，男，21歲，本科生；主要從事野生動物生理生態(tài)學研究。

*通訊作者：柴龍會，E-mail：chailonghui@126.com