虎皮鸚鵡全基因組中微衛星分布規律研究

黃 杰 原寶東 楊承忠

(1.商丘師范學院生物與食品學院，商丘，476000；2.重慶師范大學生命科學學院，重慶，401331)

虎皮鸚鵡全基因組中微衛星分布規律研究

黃 杰1原寶東1楊承忠2*

(1.商丘師范學院生物與食品學院，商丘，476000；2.重慶師范大學生命科學學院，重慶，401331)

對虎皮鸚鵡(Melopsittacusundulatus)全基因組中微衛星分布特征進行了分析，查找到l～6個堿基重復類型的微衛星序列共90 346個，約占整個基因組總長度的序列(1.1 Gb)的0.41%，分布頻率為82.9/Mb。不同類型微衛星中，單堿基重復類型數目最多，為50 349個，占總數的55.7%；其次是二、四、三、五、六堿基重復單元序列，分別占到總數的16.3%，13.7%，10.8%，2.9%，0.5%。單堿基微衛星中A重復類型數量最多，二堿基中AT最多，三堿基中AAT，四堿基中AAAC最多，五堿基中AAAGA最多，六堿基中AACCCT最多。A、AT、C、AC、AAT、AAAC、AAAT、AGG、AGC、AG、AAAG、AAC、ATCC、AAGG、AGAT、ATC、AACC、ACC依次是虎皮鸚鵡基因組中分布數量最多的18種微衛星重復拷貝類型。本研究將為虎皮鸚鵡微衛星標記的分離篩選、遺傳多樣性的研究以及不同物種微衛星的比較分析奠定了基礎。

虎皮鸚鵡；基因組；微衛星

微衛星標記(microsatellite)，又稱為簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)，一般由1～6個核苷酸的串聯重復片段構成。作為一種優良的分子遺傳標記，因其具有多態信息含量高、分布廣泛、共顯性遺傳、易于檢測等優點而倍受研究者們的青睞。近年來常被用于動物的遺傳疾病研究[1]，以及個體識別(包括親子鑒定)[2-3]，種群遺傳多樣性分析[4-5]，基因連鎖分析、系統發育[6]等方面的研究。

虎皮鸚鵡(Melopsittacusundulatus)是隸屬鸚形目(Psittaciformes)鸚鵡科(Psittacidae)的鳥類。這種鳥原產澳大利亞，其羽毛華麗，易于飼養，可大量繁殖，經人工培育已成為世界性籠養鳥，深受大眾喜愛，全世界的總數量超過500萬只[7]。目前，虎皮鸚鵡的研究主要集中在其人工繁殖、發聲行為、疾病、地震預警等方面的研究[8-11]，在分子生物學方面研究相對較少，主要集中于系統進化等方面[12-14]。本研究采用生物信息學的方法，通過微衛星搜索軟件首次查找虎皮鸚鵡全基因組中的微衛星序列，并分析微衛星的豐度及其分布規律，為進一步篩選微衛星位點、群體遺傳多樣性、品種選育及親緣關系等研究提供數據基礎。

1 研究方法

1.1 虎皮鸚鵡基因組序列的獲取

虎皮鸚鵡全基因組序列由 http：//www.diark.org/diark/species網站下載，基因組總長度約1.1 Gb，所有序列均以FASTA文件格式保存。

1.2 數據分析

本研究采用微衛星搜索及統計軟件MSDB v2.4(http：//msdb.biosv.com)[15]，從下載得到的虎皮鸚鵡基因組序列中尋找微衛星序列。本研究搜索微衛星的標準是：(1)要求單堿基12次重復以上，二堿基7次重復以上，三堿基5次重復以上，四堿基、五堿基和六堿基4次重復以上，且搜索的微衛星均為完美型微衛星[15-16]；(2)考慮到堿基互補配對原則以及起始堿基的排列差異，將所有可循環的序列及其互補序列歸為一類，比如ATC核心重復序列代表所有TCA、CAT、TAG、AGT和GTA的微衛星。總體來說，單堿基重復有A、C兩種獨特類型；二堿基重復有AC、AG、AT、GC 4種獨特類型；三堿基重復有10種獨特類型；四堿基重復有33種獨特類型，五堿基重復有102種獨特類型；六堿基重復有350種獨特類型。

關于微衛星序列分布特征的統計術語定義參考黃杰等[17]，具體如下：(1)重復類型：指微衛星序列中核心重復序列是由幾個堿基組成，按照核心重復序列的堿基組成數量，微衛星序列可以分為單堿基(mononucleotide)、二堿基(dinucleotide)、三堿基(trinucleotide)、四堿基(tetranucleotide)、五堿基(pentanucleotide)以及六堿基(hexanucleotide)這6種重復類型。(2)重復拷貝類別：指各重復類型具體由哪些堿基構成，例如三堿基重復類型ATC和ACT 分別屬于不同的重復拷貝類別，而TCA、CAT 和ATC 則屬于相同的重復拷貝類別。(3)重復拷貝數：指一個微衛星序列中其核心序列的重復次數，例如(ACCG)15，該微衛星的重復拷貝數是15。(4)豐度(個/Mb)：指1個物種基因組中每Mb序列包含的微衛星序列數量。

2 結果

2.1 各類型微衛星重復序列數目和相應的百分比

在公共數據庫下載到已公布的虎皮鸚鵡基因組1.1 Gb(1，117，355，426 b)序列中，用MSDB v2.4微衛星搜索軟件共搜索到90 346個不同類型重復序列，其出現頻率是82.9/Mb，合計長度達1.47 Mb，占到整個基因組總長度的0.41%。 所有的重復類型如表1所示，單堿基重復數目最多，為50 349個，豐度為45.1個/Mbp，占重復序列總數目的55.7%；其次是二堿基為14 702個，豐度為13.2個/Mbp，占16.3%；四堿基重復類型，為12 408個，豐度為13.1個/Mbp，占有微衛星序列總數量的13.7%；三堿基為9 795個，豐度為8.8個/Mbp，占10.8%；五堿基為2 609個，豐度為2.3個/Mbp，占2.9%；最少的是六堿基重復，為15 558個，豐度為0.4個/Mbp，僅占微衛星序列總數量的0.5%(表1)。

表1 不同重復類型的微衛星在虎皮鸚鵡基因組的分布情況

Tab.1 Distribution of SSR for different repeat types in genomic of Melopsittacus undulatus

2.2 各種重復拷貝類別的數量和相應的比例

同一種類型的微衛星重復序列中，不同重復拷貝類別占該重復類型微衛星總量的比例也有所差異(表2)。單堿基重復類型中，拷貝類別為A的重復類型數目最為豐富，有44 144個，占單堿基重復序列總數目的87.7%，C重復拷貝類別的數量很少，只有6 205個，僅占了12.3%；二堿基重復類型中，AT重復拷貝類別最多，占二堿基總重復序列數目的53.2%，有7 816個，其次是AC(36.9%)和AG(4.8%)，CG類別數量最少，僅有26個，占0.2%；三堿基重復類型中，10種重復拷貝類別中數量最多的是AAT，有3 563個，占三堿基微衛星序列總數的36.4%；CCG類別數量最少，僅有9個，占0.1%，其他類型如表2所示。由于四、五和六堿基重復類型的重復拷貝類別較多，因此我們僅列舉了數量較多的部分拷貝類別。四堿基微衛星重復類型中，AAAC重復拷貝類別數量最多，為3 207個，占四堿基類型總數的25.8%，其次 AAAT(23.3%)、AAAG(8.3%)、ATCC(7.1%)。其他的類別數量相對較少，數量均小于800個。五堿基中，AAAGA重復拷貝類別數量最多，有383個，占14.7%，其次是AAACA(13.5%)、AAATA(10.6%)、AAAGG(6.3%)、ATCCC(4.5%)和AATGG(4.1%)，其他重復拷貝類別數量均不到100個。六堿基微衛星中，重復拷貝類別數量最多的是AACCCT，有97個，占了六堿基重復的20.1%。

表2 虎皮鸚鵡基因組中分布頻率最高的微衛星重復類型

Tab.2 The most frequent microsatellite motifs found in the Melopsittacus undulatus genome

2.3 虎皮鸚鵡基因組中含量豐富的重復拷貝類別及其拷貝數的分布

如圖2所示，在虎皮鸚鵡基因組中微衛星數量最多的前18種重復拷貝類別依次為A、AT、C、AC、AAT、AAAC、AAAT、AGG、AGC、AG、AAAG、AAC、ATCC、AAGG、AGAT、ATC、AACC、ACC。其中均為單堿基、二堿基、三堿基和四堿基重復類型，而且這些重復拷貝類別的微衛星數量都在500個以上，總數是83 968個，占所搜索到的微衛星重復拷貝類別總數的92.94 %，而其他所有拷貝類別僅占7.06%，而較長的重復單元并未出現在數量最多的18重復拷貝類別中。另外，在基因組中出現次數超過100次的微衛星有36種重復拷貝類別，總數占基因組全部微衛星總數的97.57%。

對于不同重復拷貝類型微衛星而言，它們的重復次數分布情況也各不相同。虎皮鸚鵡基因組重復拷貝類別中，(A)n是分布最多的微衛星類型，重復拷貝次數集中分布在12～30次，最多重復次數是39次。其次是二堿基重復拷貝類型(AT)n，最長重復次數是30次，此種重復拷貝類型的微衛星重復拷貝次數集中分布在7～11次。短的重復類型(單堿基、二堿基)比長的重復單元(三堿基、四堿基)的分布更加廣泛。不同重復拷貝類型微衛星重復次數的分布情況雖然各不相同，但是不同重復拷貝類型中，均可以發現重復拷貝次數少的類型所占該類型微衛星總數的比例最高。

圖2 虎皮鸚鵡基因組中分布最多的不同 重復拷貝類型微衛星Fig.2 Distribution of the most frequent microsatellite motifs of Melopsittacus undulatus

表3 分布頻率最高的重復拷貝類型微衛星的拷貝數分布情況

Tab.3 Distribution of the copy repeats number of the most frequent microsatellite motifs

3 討論

本文以虎皮鸚鵡基因組序列為基礎，利用微衛星搜索軟件搜索并統計分析了該鳥的基因組中完美型微衛星的分布特征和彼此之間的差異性。分析發現，1.1 Gb的虎皮鸚鵡基因組序列中搜索到不同的微衛星總數有90 346個，全部微衛星序列總長度達1.47 Mb，占到整個基因組序列長度的0.41%。與人類(3%)，小鼠(2.85%)，牛(4.7%)、綿羊(4.8%)，大熊貓(0.64%)，北極熊(0.79%)[18-21]等多種高等脊椎動物基因組中相比，微衛星序列在虎皮鸚鵡基因組中分布相對較少。這與Primmer等[22]預測鳥類基因組中微衛星的密度會比人基因組中微衛星的密度低很多的觀點相一致。但該比例與其他鳥類，如原雞(Gallusgallus)(0.49%)，四川山鷓鴣(Arborophilarufipectus)(0.43%)等相差不大[17，23]。

不同物種基因組中的微衛星序列分布特征的差異可以作為衡量不同物種基因組差異的一個指示[24]。微衛星類型在不同物種間豐度有一定差異，不同物種在基因組中微衛星密度和堿基組成上也存在著較大差異[23]。本研究發現，在不同重復類型的虎皮鸚鵡微衛星中，單堿基微衛星占主導地位(55.7%)，這一結果進一步支持了黃杰等[17]發現的高等生物基因組傾向于單堿基微衛星類型占主導地位這一特點。如果不將單堿基類型考慮在內，虎皮鸚鵡基因組微衛星中二堿基微衛星類型數量占優勢，這與已公布的四川山鷓鴣和紅原雞已四堿基重復類型占主導不同[17，23]。所以，對于鳥類基因組是否具有四堿基微衛星的偏好需要進一步的研究證據。但虎皮鸚鵡四堿基重復微衛星類型中，以AAAB(B代表除A以外的任何堿基)重復拷貝類別含量最豐富，這一結果與嚙齒類、靈長類、維管束植物、真菌類以及原雞、四川山鷓鴣的研究結果一致[17，23，25]。

虎皮鸚鵡單堿基重復類型以(A)n為主(占單堿基重復序列堿基數的87.7%)；二、三、四、五、六堿基重復類型分別以AT，AAT，AAAC，AAAGA，AACCCT重復單元分布最多，這表明微衛星的分布對A和T堿基具有偏好性。在中國對蝦、蜜蜂、蚊子、果蠅等基因組中也出現了相似結果[26-29]。雖然不同物種基因組微衛星分布特征有差異，但均發現富含G和C的微衛星出現頻率較低。研究也發現，GC含量越高的序列中微衛星越少[30]。普遍認為，微衛星是DNA復制過程中滑移而產生的[31-32]，但可能由于C≡G 之間的鍵比A=T難斷裂，GC含量高的序列復制過程中不易發生滑動，因而DNA序列發生滑動復制的概率與序列GC含量成負相關。

對基因組認識水平的提高以及生物信息學的發展，使微衛星的研究也越來越方便高效。本研究通過對虎皮鸚鵡基因組微衛星序列的掃描和分布特征分析，一方面，掃描出大量的微衛星序列為該種鳥微衛星標記的開發提供了充足的數據基礎；另一方面，為研究虎皮鸚鵡連鎖圖譜以及種群遺傳學等方面的研究奠定了基礎。

[1] Ludovini V，Pistola L，Gregorc V，et al.Plasma DNA，microsatellite alterations，and p53 tumor mutations are associated with disease-free survival in radically resected non-small cell lung cancer patients：a study of the perugia multidisciplinary team for thoracic oncology[J].Journal of Thoracic Oncology，2008，3(4)：365-373.

[2] Huang J，Li Y Z，Du L M，et al.Genome-wide survey and analysis of microsatellites in giant panda(Ailuropodamelanoleuca)，with a focus on the applications of a novel microsatellite marker system[J].BMC Genomics，2015，16(1)：61.

[3] Beacham T D，McIntosh B，Wallace C.A comparison of stock and individual identification for sockeye salmon(Oncorhynchusnerka)in British Columbia provided by microsatellites and single nucleotide polymorphisms[J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，2010，67(8)：1274-1290.

[4] Huang J，Zhu D，Song X，et al.High-throughput microsatellite markers discovery for the Sichuan hill partridge(Arborophilarufipectus)and assessment of genetic diversity in the Laojunshan population[J].Biochemical Systematics and Ecology，2015，60：266-272.

[5] Page R B，Sankamethawee W，Pierce A J，et al.High throughput sequencing enables discovery of microsatellites from the puff-throated bulbul(Alophoixuspallidus)and assessment of genetic diversity in Khao Yai National Park，Thailand[J].Biochemical Systematics and Ecology，2014，55：176-183.

[6] Kucuktas H，Wang S，Li P，et al.Construction of genetic linkage maps and comparative genome analysis of catfish using gene-associated markers[J].Genetics，2009，181(4)：1649-1660.

[7] Perrins C.The new encyclopedia of birds[M].Oxford：Oxford University Press，2003.

[8] Ramis A，黃瑜.虎皮鸚鵡同時暴發喙羽病病毒和多瘤病毒感染[J].國外畜牧科技，1999，26(6)：37-40.

[9] 鐘福生，曾元根，莫小林，等.虎皮鸚鵡人工繁殖的研究[J].經濟動物學報，2001，5(2)：43-46.

[10] 江文科，李東風.鳴管神經支對虎皮鸚鵡鳴叫聲的支配[J].華南師范大學學報：自然科學版，2015，47(2)：90-95.

[11] 李均之.虎皮鸚鵡異常行為與臨震預測[J].北京工業大學學報，2008，34(2)：216-219.

[12] Schweizer M，Seehausen O，Güntert M，et al.The evolutionary diversification of parrots supports a taxon pulse model with multiple trans-oceanic dispersal events and local radiations[J].Mol Phylogenet Evol，2010，54(3)：984-994.

[13] Wright T F，Schirtzinger E E，Matsumoto T，et al.A multilocus molecular phylogeny of the parrots(Psittaciformes)：support for a Gondwanan origin during the Cretaceous[J].Mol Biol Evol，2008，25(10)：2141-2156.

[14] Tokita M，Kiyoshi T，Armstrong K N.Evolution of craniofacial novelty in parrots through developmental modularity and heterochrony[J].Evol Dev，2007，9(6)：590-601.

[15] Du L M，Li Y Z，Zhang X Y，et al.MSDB：a user-friendly program for reporting distribution and building databases of microsatellites from genome sequences[J].Journal of Heredity，2012，104(1)：154-157.

[16] 汪自立，黃杰，杜聯明，等.二斑葉螨和肩突硬蜱基因組微衛星分布規律研究[J].四川動物，2013，32(4)：481-486.

[17] 黃杰，周瑜，劉與之，等.基于454 GS FLX高通量測序的四川山鷓鴣基因組微衛星特征分析[J].四川動物，2015，34(1)：8-14.

[18] Subramanian S，Mishra R K，Singh L.Genome-wide analysis of microsatellite repeats in humans：their abundance and density in specific genomic regions[J].Genome Biology，2003，4(2)：R13.

[19] 童曉玲，代方銀，李斌，等.小鼠基因組中的微衛星重復序列的數量、分布和密度[J].動物學報，2006，52(1)：138-152.

[20] 戚文華，蔣雪梅，肖國生，等.牛和綿羊全基因組微衛星序列的搜索及其生物信息學分析[J].畜牧獸醫學報，2013，44(11)：1724-1733.

[21] 李午佼，李玉芝，杜聯明，等.大熊貓和北極熊基因組微衛星分布特征比較分析[J].四川動物，2014，33(6)：874-878.

[22] Primmer C R，Raudsepp T，Chowdhary B P，et al.Low frequency of microsatellites in the avian genome[J].Genome Res，1997，7(5)：471-482.

[23] 黃杰，杜聯明，李玉芝，等.紅原雞全基因組中微衛星分布規律研究[J].四川動物，2012，31(3)：358-363.

[24] 馬秋月，戴曉港，陳贏男，等.棗基因組的微衛星特征[J].林業科學，2013，49(12)：81-87.

[25] Tóth G，Gáspári Z，Jurka J.Microsatellites in different eukaryotic genomes：survey and analysis[J].Genome Res，2000，10(7)：967-981.

[26] 高煥，劉萍，孟憲紅，等.中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)基因組微衛星特征分析[J].海洋與湖沼，2004，35(5)：424-431.

[27] 魏朝明，孔光耀，廉振民，等.蜜蜂全基因組中微衛星的豐度及其分布[J].昆蟲知識，2007，44(4)：501-504.

[28] Yu Quanyou,Li Bin,Li Guanrong,et al.Abundance and distribution of microsatellites in the entire mosquito genome[J].Prog Biochem Biophys,2005,32(5)：435-441.

[29] Kim T S，Booth J G，Gauch H G，et al.Simple sequence repeats inNeurosporacrassa：distribution，polymorphism and evolutionary inference[J].BMC Genomics，2008，9(1)：31.

[30] Schl?tterer C.Genome evolution：are microsatellites really simple sequences?[J].Curr Biol，1998，8(4)：R132-R134.

[31] Schl?tterer C，Tautz D.Slippage synthesis of simple sequence DNA[J].Nucleic Acids Res，1992，20(2)：211-215.

[32] Zhao X，Tan Z，Feng H，et al.Microsatellites in differentPotyvirusgenomes：survey and analysis[J].Gene，2011，488(1/2)：52-56.

Distribution of Microsatellites in Genome of Budgerigar(Melopsittacusundulatus)

Huang Jie1Yuan Baodong1Yang Chengzhong2*

(1.College of Biology and Food Sciences，Shangqiu， 476000，China；2.College of Life Science，Chongqing Normal University， Chongqing，401331，China)

We analyzed the distribution of microsatellites in the entire genome of budgerigar(Melopsittacusundulatus).A total of 90 346 simple sequence repeats(SSRs)with 1～6 bp nucleotide motifs were identified，means that about 0.41% of the budgerigar genome was occupied by SSRs.And the frequency of SSR was 82.9/Mb.In the different repeat types of the microsatellites，mononucleotide repeat motifs was the most abundant type(55.7%)，while the tetranucleotide，dinucleotide，trinucleotide，pentanucleotide and hexanucleotide repeats were 16.3%，13.7%，10.8%，2.9% and 0.5%，respectively.Moreover，A，AT，AAT，AAAC，AAAGA，AACCCT were the most frequent repeat copy units of the six motif types，respectively.In the budgerigar genome，A，AT，C，AC，AAT，AAAC，AAAT，AGG，AGC，AG，AAAG，AAC，ATCC， AAGG，AGAT，ATC，AACC，and ACC were the predominant repeat types． This study will facilitate the isolation of microsatellites and the genetic diversity analysis of budgerigar，and serve as a foundation for comparative studies of microsatellites in different species．

Melopsittacusundulates；Genome；Microsatellite

稿件運行過程

2016-12-07

修回日期：2017-02-11

發表日期：2017-08-10

Q78 Q953

A

2310-1490(2017)03-422-05

國家自然科學基金項目(No.31501845)，商丘師范學院高層次人才科研啟動項目(No.50013901;50014001)

黃杰，女，30歲, 博士; 主要從事動物學方面研究。

*通訊作者：楊承忠， E-mail：drczyang@126.com