高效液相色譜法測定黃酒中紐甜的不確定度評定

衛(wèi)星華，李 卓，張亞鋒，艾 蕓，高安成

（西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054）

高效液相色譜法測定黃酒中紐甜的不確定度評定

衛(wèi)星華，李 卓，張亞鋒，艾 蕓，高安成

（西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054）

建立了高效液相色譜法測定黃酒中紐甜含量不確定度的分析方法。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》及CNAS-GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》中不確定度評定的基本程序，建立數(shù)學(xué)模型，分析高效液相色譜法測定黃酒中紐甜含量過程中引入的各測量不確定度分量，計算得到測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度。結(jié)果表明：影響檢測結(jié)果不確定度的因素主要是校準(zhǔn)曲線擬合求濃度，其次是樣品前處理及測定和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.016 13、0.011 27、0.007 90。其中樣品前處理及測定因素中貢獻大的分量是通過樣品重復(fù)性引入的相對不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.009 61。

不確定度；紐甜；高效液相色譜法；黃酒

紐甜是一種功能性甜味劑，具有純正的甜味，甜味協(xié)和，與阿斯巴甜相似，但安全性較高。紐甜在食品中應(yīng)用廣泛，相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)[1]中規(guī)定了其的使用范圍和最大使用量。酒中適量添加紐甜可改善酒質(zhì)，協(xié)調(diào)平衡酒的香氣、口感，降低固形物含量，使酒的風(fēng)味更加醇厚[2]。

現(xiàn)在很多重要的決策都是建立在定量分析的結(jié)果基礎(chǔ)上，無論采用什么方法進行檢測，測定的結(jié)果都有一定的不確定度。不確定度是檢測結(jié)果的重要部分，反映了檢測結(jié)果的可靠性以及檢測過程中各項不確定度來源對測定結(jié)果的影響程度。測量不確定度即表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[3]。由于高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）具有靈敏度高、分析檢測準(zhǔn)確等特點，本研究根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》及中國合格評定國家認(rèn)可委員會CNAS-GL06—2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》中不確定度評定的基本程序，建立數(shù)學(xué)模型，參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4-6]及文獻[7-14]評定黃酒中紐甜含量的不確定度，為實驗室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，同時為測量黃酒中其他添加劑含量的不確定評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒：市售；紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.4%）：美國Sigma-Alorich公司，批號BCBR2263V；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；甲酸（分析純）、三乙胺（分析純）、磷酸氫二銨（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）、紫外可見光檢測器）：塞默飛世爾科技有限公司；Milli-Q純化水機：密理博（中國）有限公司；ME204E及MS105電子分析天平：美國Mettler Toledo集團公司；KQ-700VDB型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取25 mg紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，加混合提取液（0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL）定容至25 mL，配制成紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。移取l mL紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用混合提取液定容于100 mL容量瓶作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線第五點、分別移取該點標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL、5 mL、1 mL、5 mL，用混合提取液定容于50 mL、100 mL、10 mL、10 mL，制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取15g黃酒試樣于50mL容量瓶中，加入30mL混合提取液（0.8mL甲酸和2.5mL三乙胺，加水定容至1000mL），振蕩混勻。超聲15 min，冷卻至室溫后用混合提取液定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后作為待測液供HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

流動相：乙腈：0.02 mol/L磷酸氫二銨=30∶70（V/V），AgelaC18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長218 nm；進樣體積10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測定原理及方法，用外標(biāo)法計算黃酒中紐甜含量，其計算公式如下：

式中：X為試樣中紐甜含量，g/kg；c為試樣溶液中紐甜的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2.2 來源分析

根據(jù)測定紐甜的數(shù)學(xué)模型，其測定不確定度的來源主要有：（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度；（2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合求濃度引入的不確定度；（3）樣品前處理引入的不確定度；（4）樣品的重復(fù)測定引入的不確定度；（5）添加回收率引入的不確定度。

2.3 各輸入量的不確定度分量分析和計算

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制引入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的純度為99.4%，按均勻分布，則紐甜標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》[14]，天平允許的最大誤差為±0.05 mg，采用減重法分兩步稱取紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，兩次稱取數(shù)值分別為58.32 mg、32.60 mg，按均勻分布計算，由兩次稱量引入的相對不確定度分別為：

（3）配制25 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積引入的不確定度

配制25 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積引入的不確定度由容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度和溫度引入的不確定度兩部分構(gòu)成。

a.容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[15]，25 mL容量瓶（A）級容量允差為±0.03 mL，按均勻分布，容量瓶校準(zhǔn)引入相對不確定度為：

b.溫度引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品使用加混合提取液定容，純水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10-4，甲酸的體積膨脹系數(shù)為1.03×10-3，三乙胺的體積膨脹系數(shù)為1.26×10-3，故混合提取液的體積膨脹系數(shù)為

2.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度主要包括移液管校準(zhǔn)引入的不確定度、容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度以及溫度引入的不確定度。與2.3.1同理，溫度引入的相對不確定度為u（t）=0.000 61，移液管校準(zhǔn)引入的不確定度和容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度如表1所示。

表1 移液管和容量瓶引入的不確定度Table 1 Uncertainty caused by pipettes and volumetric flasks

配制紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

分別取不同質(zhì)量濃度（0.200 μg/mL、0.510 μg/mL、1.020μg/mL、5.100μg/mL、10.200μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液測定，得到相應(yīng)的色譜峰面積（0.00872、0.03646、0.07152、0.40588、0.80246），擬合而成的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為A=0.07953C-0.005 93，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 86。取一陽性樣品，進行6次重復(fù)檢測，由最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：a為曲線的斜率，a=0.07953；b為曲線的截距，b=-0.00593；為樣品的平均質(zhì)量濃度=2.169 06 μg/mL；P為樣品的測定次數(shù)，P=6；n為標(biāo)曲的測定次數(shù)，n=5為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度的平均值，=（0.204+0.51+1.02+5.1+10.2）/5=3.406 8 μg/mL。

將標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度及峰面積相應(yīng)數(shù)值代入公式（2），可得s（c）=0.004 47，故標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（c）=0.034 99。

故用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測樣品值所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 樣品前處理及測定引入的不確定度

（1）樣品稱量引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，實驗所用天平允許誤差為±0.000 5 g，稱取黃酒樣品15.012 3 g，按均勻分布計算，由稱量引入的相對不確定度分別為：

（2）樣品定容引入的不確定度

樣品定容至50mL容量瓶中，由表1可知A類50 mL單標(biāo)線容量瓶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4=0.000 58，溫度引入的相對不確定度為u（vt）=0.000 61，則樣品定容引入的不確定度

（3）樣品重復(fù)性引入的不確定度

重復(fù)性引入的不確定度，主要受操作人員的熟練程度及儀器本身性能等因素的影響，并包含了濃度（c）、體積（V）和質(zhì)量（m）測量時的重復(fù)性不確定度的分量，該不確定度屬A類評定。對樣品進行6次重復(fù)測定，含量分別為0.00710g/kg、0.007 27 g/kg、0.007 13 g/kg、0.007 37 g/kg、0.007 02 g/kg、0.007 45 g/kg，平均含量為0.007 22 g/kg，應(yīng)用貝塞爾公式計算單次測量結(jié)果的實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為：

（4）樣品回收率引入的不確定度

對上述樣品進行了6次加標(biāo)回收率實驗，添加水平為0.006 80 g/kg，所得回收率如表2所示。

表2 樣品回收率實驗結(jié)果Table 2 Results of the recovery rate tests of sample

2.3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度

各不確定分量相互獨立，因此相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，高效液相色譜法測定黃酒中紐甜含量測量結(jié)果可表示為（0.007 22±0.000 32）g/kg。

3 結(jié)論

本實驗評定了高效液相色譜法測定黃酒中紐甜含量的不確定度，通過評定可以得出，影響測量結(jié)果不確定度的主要因素是校準(zhǔn)曲線擬合求濃度，其次是樣品前處理及測定和紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.016 13、0.011 27、0.007 90。其中樣品前處理及測定因素中貢獻大的分量是通過樣品重復(fù)性引入的相對不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.009 61。而試樣稱量引入的不確定度較小可以忽略不計。在日常實驗過程中，應(yīng)盡量保持儀器較高的靈敏度，穩(wěn)定儀器狀態(tài)，并定期對所涉儀器進行檢定，從而減小測量不確定度。

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 2760—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[2]彭飛進.高效液相色譜法測定白酒中紐甜含量[J].云南化工，2012，39（5）：45-47.

[3]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.CNAS-GL06：2006化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S].北京：中國計量出版社，2006.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.247—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 27411—2012檢測實驗室中常用不確定度評定方法與表示[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員.JJF 1059.1—2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[7]李菊穎，何 健，孔德洋，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中多菌靈殘留量的不確定度分析[J].食品科學(xué)，2015，36（22）：169-172.

[8]趙 貞，萬 鵬，劉春霞，等.高效液相色譜法檢測乳品中3種甜味劑[J].中國釀造，2014，33（1）：147-149.

[9]曹 峰，許 霞.高效液相色譜法測定萊蕪姜酒中的紐甜含量[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2014，32（6）：77-80.

[10]姜 雪，蘇媛媛，吳小松，等.液相法測定焦糖色中4-甲基咪唑的不確定度評定[J].中國釀造，2013，32（2）：133-138.

[11]邵亮亮，趙美鳳，寧 暉，等.高效液相色譜法測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的不確定度評定[J].食品科學(xué)，2016，37（12）：232-237.

[12]時曉曼，張 敏，陳 颯.液相色譜法測定水中苯丙[a]芘的不確定度評估[J].計量與測試技術(shù)，2017，44（1）：51-53，58.

[13]楊瑩瑩.氣相色譜法測定食醋中鄰苯二甲酸二丁酯及其不確定度評定[J].中國釀造，2017，36（1）：171-175.

[14]梁桂娟，尋思穎，李清偉，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定醬油中三氯蔗糖的不確定度評估[J].中國釀造，2016，35（8）：66-68.

[15]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員.JJG 1036—2008電子天平檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2008.

[16]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員.JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2006.

Uncertainty evaluation in the determination of neotame in Chinese rice wine by HPLC

WEI Xinghua,LI Zhuo,ZHANG Yafeng,AI Yun,GAO Ancheng
(Xi'an Institute for Food and Drug Control,Xi'an 710054,China)

A methodology of uncertainty evaluation for the determination of neotame in Chinese rice wine by HPLC was proposed.According to the procedure for uncertainty assessment described in JJF 1059.1-2012 Evaluation of uncertainty in chemical analysis measurement and CNAS-GL06：2006 guidance on Evaluating the uncertainty in chemical analysis,a mathematical model was established,and the components of uncertainty during the determination of neotame in Chinese rice wine by HPLC were analyzed,and then the combined uncertainty and the expanded uncertainty were calculated.The results showed that the major factor affecting the measurement uncertainty was liner fitting curve,followed by sample pretreatment and determination,standard solution preparation.The relative standard uncertainty were 0.016 13,0.011 27 and 0.007 90,respectively.Among them,the large contribution of sample pretreatment and determination factors was the relative uncertainty introduced by the repeatability of samples,and the relative standard uncertainty was 0.009 61.

uncertainty;neotame;HPLC;Chinese rice wine

O657.7

0254-5071（2017）10-0167-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.035

2017-07-05

陜西省食品藥品快速檢測公共服務(wù)平臺建設(shè)（2014FWPT-01）

衛(wèi)星華（1982-），女，工程師，碩士，研究方向為食品分析。