中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

該實驗旨在利用芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸桿菌（Lactobacillus）發酵棉粕，研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料活菌數的影響。研究發現，芽孢桿菌BLCC1-0039在37℃發酵24 h后棉酚降解率達到85.89%（P＜0.05），產中性蛋白酶活性達到2 811.40 U/g發酵料（P＜0.05）；發酵48 h時棉酚降解率達到91.47%，產中性蛋白酶活性達到2303.24 U/g。單獨添加中性蛋白酶發酵24 h時，添加量為1 000 U/g的棉酚降解率已達到58.46%，2 000 U/g時棉酚降解率達到72.68%；發酵48 h時1 000 U/g的棉酚降解率已達到73.29%。乳酸菌發酵棉粕不能降解棉酚，但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發酵24 h時，棉酚降解率達到67.13%，pH值降至4.71。

中性蛋白酶；棉酚；棉粕；芽孢桿菌；乳酸桿菌

我國蛋白質飼料資源嚴重短缺，而棉粕產量高且價格低廉，棉粕蛋白含量高達38%～50%，粗纖維約11%，此外B族維生素、硫胺素和有機磷也比較多[1-2]，同大豆粕一樣是重要的蛋白質飼料資源[3]。然而，棉籽餅中含有棉酚、環丙稀脂肪酸、單寧等抗營養因子物質，其中最主要的是棉酚，如果未經脫毒長期飼喂畜禽，則很易引起中毒甚至死亡，嚴重降低飼用價值[4-5]。目前，降解棉酚的方法主要有化學法、物理法和微生物發酵法等，其中微生物發酵法可以將棉酚轉化為其他物質，達到脫毒目的，既不產生其他副產物，又可提高粗飼料的營養價值，增加適口性和采食量，是目前普遍認為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法[6-8]。但不同微生物菌種對棉酚的降解能力有較大的差異，篩選優良的微生物菌種是影響棉籽餅粕脫毒效果和營養價值的首要步驟。

中性蛋白酶主要作用為在中性條件下水解蛋白質的肽鍵，釋放氨基酸或者多肽，最早發現并應用于生產的工業酶制劑，現已廣泛應用于皮革、毛皮、絲綢、醫藥、食品、釀造等方面[9]，近年來更發展出許多新的用途[10-11]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[12]，是當今工業酶的主要生產菌種之一，是工業生產上應用最廣泛的菌種之一，其產中性蛋白酶能力為芽孢菌生長的主要的考察指標[13]。據報道，枯草芽孢桿菌發酵棉粕，特別是加入木瓜蛋白酶后可有效提高棉粕的營養價值[14]。目前報道的用于棉籽餅粕脫毒的芽孢菌的相關研究有枯草芽孢桿菌菌株M-9[15]和菌株M-4[16]，這兩株菌對棉酚具有較高的降解活性。乳酸菌發酵飼料作為功能性飼料，具有氣味香、適口性好、飼喂簡單方便、消化率高、功效穩定等優勢，具有良好的生產和應用價值[17-18]。但是兩種菌單獨發酵時也存在一定不足，如枯草芽孢菌發酵過程中脫羧或脫氨作用會產生有機酸和氨氣，會有刺鼻的氨味，乳酸菌降解棉酚效果不顯著等。本研究旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌對棉粕進行固態發酵，充分利用兩種菌的優勢，達到降低棉酚含量，同時提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品質的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發酵原材料及菌株

棉粕由新疆泰昆生物集團提供，粉碎過40目篩。

芽孢桿菌（Bacillus）菌株：BLCC1-0039、BLCC1-0090、BLCC1-0157和BLCC1-0169；乳酸桿菌（Lactobacillus）菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司保存。中性蛋白酶（酶活性50 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司。

1.1.2 培養基

酵母膏蛋白胨培養基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

MRS培養基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟南匯豐達化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實業有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉、磷酸、氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；以上試劑均為分析純。乙腈、丙酮（色譜級）、甲醇（色譜級）：天津市永大化學試劑有限公司；微孔濾膜（直徑13mm、孔徑0.45μm）：上海安譜有限公司；棉酚標準品（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LDE-2A低速離心機：北京時代北利離心機有限公司；SHB-ⅢS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE52CS旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SB1200超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備

取經過兩次活化的芽孢菌斜面一環于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養基的500 mL三角瓶中，于37℃、180 r/min搖床培養24 h，待用。取經過兩次活化的乳酸菌斜面一環于裝有100 mL MRS培養基的500 mL三角瓶中，37℃靜置培養24 h待用。

1.3.2 芽孢桿菌的篩選

生料發酵。稱取一定量的基料于1 000 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量100 g/瓶，按2%接種量分別接入培養好的芽孢菌種子液，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于37℃培養箱進行需氧發酵，分別于發酵24h和48h取樣，測定發酵樣芽孢菌活菌數、中性蛋白酶活性及棉酚含量。優選芽孢菌活菌數較高、產中性蛋白酶活性較高并能有效降解棉酚含量的菌株。

1.3.3 乳酸桿菌的篩選

生料發酵。稱取一定量的基料裝袋，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量100 g/袋，按2%接種量分別接入培養好的乳酸菌種子液，密封。每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于37℃培養箱進行厭氧發酵，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定發酵樣乳酸菌活菌數、pH值及棉酚含量。優選乳酸菌活菌數較高且pH值較低的菌株。

1.3.4 棉粕中添加不同濃度中性蛋白酶發酵

生料發酵。稱取一定量的基料裝袋，裝量100 g/袋，設置中性蛋白酶濃度梯度為0、1 000 U/g、2 000 U/g、4 000 U/g和8 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混勻，密封。每個樣品設3個平行，均置于37℃培養箱進行厭氧發酵，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定發酵樣棉酚含量。

1.3.5 乳酸菌加中性蛋白酶發酵

生料發酵。稱取一定量的基料裝袋，裝量100 g/袋，根據1.3.4種篩選的最優中性蛋白酶添加量1 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混勻，密封。每個樣品設3個平行，均置于37℃培養箱進行厭氧發酵，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定發酵樣乳酸菌活菌數、pH值及棉酚含量。

1.3.6 測定指標及方法

（1）pH值的測定

取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

（2）芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數的測定

準確稱取發酵棉粕10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至酵母膏蛋白胨培養基及MRS培養基中，37℃培養48 h，根據菌落數計算樣品中芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數，結果用CFU/g發酵料表示。

（3）中性蛋白酶活性的測定

取發酵棉粕1.0 g，采用福林-酚試劑法測定樣品中中性蛋白酶活性。中性蛋白酶酶活定義：1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位，以U/g表示。

（4）棉酚含量的測定[19]

棉酚標準溶液的配制：準確稱取棉酚標準品用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶解得到1.21 mg/mL的標準品貯備液，貯備液再用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）稀釋成121 μg/mL的標準品工作液。用流動相將標準品工作液逐級稀釋得到質量濃度分別為61.50 μg/mL、20.17 μg/mL、5.04 μg/mL、2.52 μg/mL和1.21 μg/mL的標準工作液，以峰面積（X）和質量濃度（Y）作圖，得到標準曲線回歸方程為：Y=0.000 005 45X+0.160 525（R2≥0.999 96），線性范圍為1.21～121.00 μg/mL。

待測樣品游離棉酚的提取：準確稱取待測樣品3.00 g，加入丙酮30 mL，超聲提取30 min，3 000 r/min 25℃離心10 min，重復提取3次，合并上清液。全部轉移至蒸發瓶中，旋轉蒸發至干，用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解，多次超聲清洗轉移至25 mL容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）測定。棉酚含量計算公式如下：

式中：c為棉酚溶液的質量濃度，μg/mL；m為樣品質量，g。高效液相色譜（HPLC）法測定棉酚含量：色譜柱為Intertsil RODS-2（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長235 nm，進樣量20 μL，柱溫25℃。

1.3.7 數據分析

試驗數據用Excel軟件進行初步處理后，采用SPSS13.0進行統計分析，采用ANOVA進行方差分析，最小顯著差異法（leastsignificantdifference，LSD）法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

不同芽孢桿菌發酵棉粕對飼料品質的影響見表1。由表1可知，除菌株BLCC1-0040在發酵24 h和48 h時活菌數在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，48 h時菌株BLCC1-0039、BLCC1-0157和BLCC1-0169均達到1010CFU/g水平，且各取樣時間點的中性蛋白酶活性也均在1 000 U/g以上，以菌株BLCC1-0039最高，發酵24 h時，中性蛋白酶活性高達2 811 U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），棉酚含量最低，降解率達到85.89%，其次為菌株BLCC1-0157，中性蛋白酶活性為1 716 U/g，棉酚降解率為81.95%，均顯著高于其他三組菌株發酵（P＜0.05）。發酵48 h時，菌株BLCC1-0039產中性蛋白酶活性達到2 303.24 U/g，棉酚降解率達91.47%，與其他菌株發酵差異顯著（P＜0.05）。綜上所述，芽孢桿菌BLCC1-0039產中性蛋白酶活性高、降解棉酚能力強，最適宜發酵棉粕。

表1 不同芽孢桿菌發酵棉粕對飼料品質的影響Table 1 Effect ofBacillusspp.on fermented feed quality

2.2 乳酸桿菌的篩選

表2 不同乳酸桿菌發酵棉粕對飼料品質的影響Table 2 Effect ofLactobacillusspp.on fermented feed quality

不同乳酸桿菌發酵棉粕對飼料品質的影響見表2。由表2可知，發酵24 h時除菌株BLCC2-0112活菌數在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，差異不顯著（P＞0.05）；pH值方面，發酵24 h時菌株BLCC2-0092和BLCC2-0001發酵的飼料pH值最低，分別為5.47和5.49，其次為菌株BLCC2-0015（5.77），48 h時三株菌發酵棉粕的pH均降至5.00以下，其中菌株BLCC2-0092發酵48 h時最低達到4.67；棉酚含量方面，各菌株間差異不顯著（P＞0.05），與對照相比幾乎均沒有降解棉酚的能力。綜合發酵活菌數和降低pH值結果來看，乳酸桿菌BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015較適宜發酵棉粕，其次為菌株BLCC2-0111。

2.3 中性蛋白酶對棉酚含量的影響

由表3可知，添加中性蛋白酶發酵棉粕降低了棉酚含量，24 h時，中性蛋白酶添加量1 000 U/g時棉酚降解率已達到58.46%；2 000 U/g的添加量時棉酚降解率最高，達到72.68%；超過2 000 U/g時，棉酚降解率并沒有隨著中性蛋白酶添加量的升高而繼續升高。48 h時，1 000 U/g時棉酚降解率最高為73.29%。說明適量中性蛋白酶的添加可有效降解棉酚，1 000 U/g的中性蛋白酶添加量已達到較優效果。

表3 不同中性蛋白酶添加量發酵對棉粕中棉酚含量的影響Table 3 Effect of neutral protease addition on fermented feed quality

2.4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發酵棉粕對飼料品質的影響

乳酸桿菌加中性蛋白酶（1 000 U/g）發酵棉粕對棉酚含量的影響見表4。由表4可知，添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發酵有效降解了棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092降解棉酚效果較好，24 h時棉酚降解率達到67.13%，其次為菌株BLCC2-0001，棉酚降解率為60.43%，均顯著高于菌株BLCC2-0015（P＜0.05）和BLCC2-0111（P＜0.05），后兩者的棉酚降解率也達到了47.0%以上；48 h時，四株乳酸桿菌棉酚降解率均在50%以上，均優于乳酸菌單獨發酵時的棉酚降解率（見表2）。活菌數在109CFU/g水平，以菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092發酵的活菌數較高。pH值方面，菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092較低，發酵24 h時pH值分別為4.62和4.71，顯著低于其他兩株（P＜0.05）。

表4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發酵棉粕對飼料品質的影響Table 4 Effect ofLactobacillusspp.with neutral protease on fermented feed quality

綜上所述，添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發酵可有效降解棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092添加1000U/g的中性蛋白酶發酵24 h時棉酚降解率為67.13%，pH值為4.71，效果最優。

3 結論

本實驗旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌發酵棉粕，研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料品質的影響。研究發現：芽孢桿菌發酵棉粕降解棉酚效果與菌株產中性蛋白酶的高低有關，棉酚降解率最優的芽孢桿菌為BLCC1-0039，37℃發酵24 h時，棉酚降解率已達到85.89%，產中性蛋白酶活性達到2 811.00 U/g發酵料；發酵48 h時，產中性蛋白酶活為2 303.24 U/g，棉酚降解率達91.47%，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。芽孢桿菌發酵棉粕可產生降解棉酚的物質，其中中性蛋白酶起著重要作用：單獨添加中性蛋白酶發酵24 h時，1 000 U/g的添加量棉酚降解率已達到58.46%，2 000 U/g的添加量時棉酚降解率達到72.68%；48 h時，1000U/g中性蛋白酶添加量的棉酚降解率最高為73.29%。乳酸桿菌無降解棉酚的能力，但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發酵24 h時，棉酚降解率達到67.13%，pH值降至4.71。

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Degradation of cottonseed meal gossypol by neutral protease

QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,ZENG Jiajia,XU Haiyan,GU Wei
(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

UsingBacillusandLactobacillusto ferment cottonseed meal,the effects of strains on the degradation rate of free gossypol and feed quality was studied.Results indicated that withBacillusBLCC1-0039 cultured at 37℃for 24 h,the degradation rate of gossypol was 85.89%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 811.40 U/g(P＜0.05).With fermentation for 48 h,the degradation rate of gossypol was 91.47%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 303.24 U/g.With the addition of 1 000 U/g neutral protease individually for 24 h fermentation,the degradation rate of gossypol was 58.46%,however,with the addition of 2 000 U/g neutral protease individually,the degradation rate of gossypol reached 72.68%.With the addition of 1 000 U/g neutral protease for 48 h fermentation,the degradation rate of gossypol reached 73.29%.Lactobacillus sp.can not degrade gossypol,but after the strain BLCC2-0092 fermentation with 1 000 U/g neutral protease for 24 h,the gossypol degradation rate reached 67.13%,pH value decreased to 4.71.

neutral protease;gossypol;cottonseed meal;Bacillus;Lactobacillus

TQ920.6

0254-5071（2017）10-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.030

2017-05-04

泰安市科技發展計劃（201540701）

亓秀曄（1987-），女，助理研究員，碩士，主要從事動物微生態制劑研發工作。