永春老醋耐酸微生物分離純化及葡萄醋發酵應用

李 巖，宋 佳，夏夢雷，馬應倫，鄭 宇*

（1.中國農業科學院 研究生院，北京 100081；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；3.福建永春老醋醋業有限責任公司，福建 泉州 362600）

永春老醋耐酸微生物分離純化及葡萄醋發酵應用

李 巖1，宋 佳2，夏夢雷2，馬應倫3，鄭 宇2*

（1.中國農業科學院 研究生院，北京 100081；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；3.福建永春老醋醋業有限責任公司，福建 泉州 362600）

該研究對永春老醋發酵過程樣品中主要微生物進行了分離純化，從中篩選出3株具有較高耐酸性菌株YCA-6、YCL-5和YCL-6，經16S rDNA序列分析發現分別屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。利用乳酸菌和醋酸菌混合微生物菌株進行葡萄醋的靜置液態發酵，利用Box-Behnken試驗對其添加比例進行了優化，并對其有機酸組成進行了分析。結果表明，菌株YCA-6、YCL-5和YCL-6接種量分別為3.0%、5.0%和5.0%的條件下混合進行葡萄醋靜置發酵獲得的葡萄醋總酸（以醋酸計）約為6.5 g/100 mL。

永春老醋；醋酸菌；乳酸菌；葡萄醋

食醋是人們日常飲食中重要的酸性調味品，現代醫學研究表明，食醋對保健養生有多種功效（如消除疲勞，增進食欲、幫助消化、平衡血液酸堿度、調節血脂血糖、降血壓、提高肝功能等）[1]。我國大部分傳統食醋采用固態發酵的工藝[2]，歐美國家普遍采用液態深層發酵[3]。

傳統的食醋釀造多采用開放式的發酵方式，過程有多種微生物參與，微生物的代謝產物與原料分解產物共同形成了發酵食品特有的風味和質構特征品質[4]。福建永春老醋又名福建紅曲醋，是我國四大名醋之一，主要以紅曲、糯米、白糖和芝麻為原料，采用傳統液態發酵法，經過多年陳釀而成，其產品酸而不澀、酸中帶甜，具有一種令人愉快的香氣[5-7]。采用非培養法與培養法對永春老醋發酵過程中細菌菌群進行研究，結果表明紅曲醋中的微生物主要有醋酸菌、乳酸菌、霉菌、酵母等，其中產酸微生物主要是醋酸菌和乳酸菌，如巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）、甲醇酸單胞菌（Acetobacter methanolica）、斯氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter swingsii）、歐羅巴葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter europaeus）等；希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[8-10]。

近年來隨著人們生活水平的提高和生產技術的進步，以水果作為原料生產的果醋及果醋飲料受到市場的青睞，消費量逐年攀升[11]。果醋是以水果或濃縮果汁為原料生產的酸性調味品，不僅營養豐富、風味獨特，而且具有保健功能。其中蘋果醋及蘋果醋飲料是消費量最大的產品[12]。目前，果醋的發酵生產主要利用純種醋酸菌，采用自吸式發酵罐進行發酵生產，該生產工藝雖然發酵效率高、過程容易控制[13-14]，但也存在產品風味單一、同質化嚴重等問題[15]。本試驗對永春老醋發酵過程主要微生物進行純化，在此基礎上優化微生物組合，利用混合微生物進行葡萄醋的液態靜置發酵，以期改善果醋風味，開發新產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 微生物

分離微生物樣品取自永春老醋發酵陳釀階段：福建永春老醋醋業有限責任公司；葡萄酒果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培養基

耐酸醋酸菌分離培養基：葡萄糖20 g/L，酵母膏0.5 g/L，蛋白胨0.5 g/L，碳酸鈣5 g/L，瓊脂25 g/L，醋酸30 g/L，乙醇體積分數3.5%。

耐酸乳酸菌分離培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 g/L，檸檬酸銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，碳酸鈣3 g/L，醋酸30 g/L，瓊脂25 g/L，pH 6.2～6.8。

種子液培養基：葡萄酒（乙醇體積分數3.5%，添加葡萄糖10 g/100 mL。

發酵培養基：葡萄酒（乙醇體積分數6.0%，總酸0.6～1.0 g/100 mL，還原糖10 g/100 mL）。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖：天津永大化學試劑開發中心；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉：北京化學試劑公司；酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀：天津市大茂化學試劑廠；硫酸銅：上海金山亭新化工試劑廠；無水乙醇、吐溫-80、氫氧化鈉、乙酸鈉、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：天津市元立化工有限公司；碳酸鈣：天津市天大化學試劑廠；濃縮葡萄汁：某飲料公司。

1.2 儀器與設備

YJ-875S醫用凈化臺：蘇州凈化設備廠；WS2-134-75電熱恒溫培養箱：天津市實驗儀器廠；1X2-1LLJ100普通光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；WYT-4手持糖度折光儀：上海精密儀器儀表有限公司；SBA-40C生物傳感儀：山東省科學院。

1.3 試驗方法

1.3.1 醋酸菌和乳酸菌的篩選

將樣品原液、10倍及102倍樣品稀釋液涂布于加有30g/L醋酸的分離培養基中篩選耐酸菌株，培養溫度30℃，挑取單菌落劃線于相應的新的平板中，進行純化。

利用添加30 g/L初始醋酸的葡萄醋發酵培養基，采用液態培養方法篩選具有較好耐酸性的醋酸菌和乳酸菌。將活化好的乳酸菌和醋酸菌分別接入發酵培養基中，在30℃條件下靜置發酵，發酵時間7d，500mL搖瓶裝液量200mL。

1.3.2 微生物的鑒定

通過革蘭氏染色，在油鏡下觀察并記錄菌體形態，并參考《伯杰氏細菌鑒定手冊（第九版）》對不同形態的細菌進行保藏。利用細菌通用引物27F和1492R進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增細菌16S rDNA，在GenBank數據庫中進行比對分析。

1.3.3 葡萄酒發酵

用無菌水將濃縮葡萄汁含糖量調至200～220 g/L，將活化好的SY酵母（稀釋后的葡萄汁25℃條件下活化30min）液按照接種量2 g/kg（以活性干酵母粉質量計）加入葡萄汁中混合均勻，在25℃條件下密閉發酵。待發酵液中還原糖含量基本穩定不變、氣泡消失則終止發酵，葡萄酒置于4℃保藏備用。

1.3.4 葡萄醋發酵

用無菌水將葡萄酒乙醇體積分數稀釋為6.0%，補加葡萄糖至還原糖10 g/100 mL，將活化好的乳酸菌和醋酸菌分別接入發酵培養基中，在30℃條件下靜置發酵，500 mL搖瓶裝液量200 mL，發酵時間30 d，每隔24 h搖晃混勻。

1.3.5 葡萄醋發酵微生物添加比例的優化

利用Design-Expert設計Box-Behnken 3因素3水平優化試驗，在發酵溫度30℃，發酵時間30 d，500 mL搖瓶裝液量200 mL的條件下優化醋酸菌YCA-6，乳酸菌YCL-5和YCL-6的接種量，以感官評分（Y）作為響應值，通過回歸方程構建擬合因素與響應值的函數關系，尋求最優的變量組合，其因素編碼水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 測定方法

有機酸組成分析：采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定葡萄醋中有機酸組成。樣品處理：將樣品進行適當稀釋，取2 mL稀釋液于2mLEP管內，以12000r/min轉速離心5 min后取上清液，濾液經0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測，每個樣品重復測定3次。HPLC檢測條件：參考文獻[16]中的方法，HPLC檢測條件如下：Aminex HPX-87H色譜柱（7.8 mm×300 mm）；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；紫外檢測器波長：215 nm；流動相：5 mmol/mL硫酸；運行時間為21 min。

總酸的測定：應用酸堿滴定法對發酵液中的酸進行測定[12]。乙醇含量：采用SBA生物傳感儀測定。糖度：采用手持折光儀進行測定。

感官評價：隨機抽取10名食品專業學生組成評分小組按照評分標準對葡萄醋進行打分，滿分10分，取平均值作為評分結果，評分標準見表2。

表2 葡萄醋感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of grape vinegar

2 結果與分析

2.1 永春老醋中耐酸微生物的篩選及菌種鑒定

通過平板分離的方法，從永春老醋樣品中分別獲得出具有較高醋酸耐受性的醋酸菌9株，乳酸菌7株，并利用添加了30 g/L醋酸的葡萄酒培養基比較其醋酸耐酸性，結果如圖1所示。

圖1 醋酸菌（A）、乳酸菌（B）菌株耐酸性比較Fig.1 Acid resistance comparison of acetic acid bacteria(A)and lactic acid bacteria(B)

根據圖1各菌株的耐酸性，選擇醋酸菌YCA-6，乳酸菌YCL-5和YCL-6進一步分析。在顯微鏡下觀察其細胞形態，結果如表3所示。

同時利用PCR方法擴增其16S rDNA進行測序分析，通過GenBank數據庫比對，初步證明醋酸菌YCA-6屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、乳酸菌YCL-5屬于瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸菌YCL-6屬于干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

表3 菌體形態觀察及種屬鑒定Table 3 Morphology and species identification of strains

2.2 混合微生物發酵葡萄醋接種量優化

設計Box-Behnken試驗，以感官評分作為響應值，優化醋酸菌YCA-6、乳酸菌YCL-5和YCL-6的接種量，結果見表4，方差分析結果見表5。由表5可知，模型項P=0.001 0，說明模型顯著性差異良好，模型擬合較好，可信度極高。失擬差P=0.060 4＞0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，結果可靠。模型的相關系數R2=0.948 6，校正系數R=0.882 6。說明模型可以解釋94.86%的感官品評，變異系數（coefficient of variation，CV）為6.73%，信噪比為9.397，試驗的可靠性高。由回歸模型和方差分析得知，方程一次項A、C，方程二次項A2、C2，交互項AB對感官評分的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；方程二次項B2對感官評分的影響達到顯著水平（P＜0.05）；方程一次項B，交互項AC、BC對感官評分的影響不顯著（P＞0.05）。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

表5 回歸模型系數及顯著性檢驗結果Table 5 Regression coefficients and significance test results for the constructed quadratic polynomial model equation

為了進一步研究相關因素之間的交互作用和各菌株最優的接種量，利用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到相應的響應面及等高線圖如圖2所示。對數據進行分析得到感官評分（Y）響應面的回歸模擬方程：Y=9.20-0.69A+0.29B+0.85C-1.03AB-0.40AC+0.20BC-1.39A2-0.84B2-1.16C2。通過方程求解可得A、B、C對應的試驗值為A=-0.52，B=0.55，C=0.50，修正后接種量分別為醋酸菌YCA-6 3.0%，乳酸菌YCL-5 5.0%，乳酸菌YCL-6 5.0%，在此條件下發酵獲得的葡萄醋感官評分最高為9.7分。

圖2 醋酸菌YCA-6、乳酸菌YCL-5、乳酸菌YCL-6接種量交互作用對葡萄醋感官品質影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between acetic acid bacteria YCA-6,lactic acid bacteria YCL-5 and YCL-6 inoculum on grape vinegar evaluation quality

2.3 混合微生物發酵葡萄醋有機酸組成分析

圖3 混合微生物發酵葡萄醋過程曲線Fig.3 Fermentation curves of grape vinegar with mixed microorganisms

利用得出的最佳接種量進行混菌靜置葡萄醋發酵，發酵過程曲線如圖3所示。由圖3可知，發酵約35 d完成，乙醇含量＜0.5 g/100 mL，總酸度為6.5 g/100 mL（以醋酸計），還原糖含量（6.00±0.26）g/100 mL。

利用HPLC對葡萄醋有機酸組成進行了分析，結果如圖4所示。生產的葡萄醋中其主要的有機酸是醋酸（55.11±0.07）g/L，此外還含有蘋果酸、乳酸、檸檬酸等多種有機酸，賦予葡萄醋豐富的口感。利用該方法生產的葡萄醋酸甜適中，口感柔和，并且具有葡萄特有的香氣。

圖4 葡萄醋中有機酸組成Fig.4 Organic acids constitute of the grape vinegar

3 結論

本研究從永春老醋發酵過程樣品中篩選到了具有較高醋酸耐受性的巴氏醋桿菌（Acetobacterpastemianu）YCA-6，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）YCL-5和干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）YCL-6，并將其應用于葡萄醋的靜置液態發酵。利用Box-Behnken試驗優化了這3株菌的添加比例，結果表明，菌株YCA-6，YCL-5和YCL-6在接種量3.0%，5.0%和5.0%的條件下發酵獲得的葡萄醋品質最好。在此條件下進行葡萄醋靜置發酵，發酵周期約35 d，葡萄醋總酸約為6.5 g/100 mL（以醋酸計），醋酸是其主要的有機酸，此外還含有蘋果酸、乳酸、檸檬酸等多種有機酸，同時含有約6.0 g/100 mL的糖，賦予葡萄醋豐富的口感。利用該工藝生產的葡萄醋，酸甜適中，口感柔和，具有葡萄特有的香氣。

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Separation and purification of acid tolerant microorganisms from Yongchun aged vinegar and their application on grape vinegar fermentation

LI Yan1,SONG Jia2,XIA Menglei2,MA Yinglun3,ZHENG Yu2*
(1.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,School of Biological Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;3.Fujian Yongchun Laocu Vinegar Industry Co.,Ltd.,Quanzhou 362600,China)

The main microorganism in Yongchun aged vinegar fermentation was isolated and purified,three strains(YCA-6,YCL-5 and YCL-6)with high acid tolerance were screened.With 16S rDNA sequence analysis,results showed that the strains were identified asAcetobacter pastemianu,Lactobacillus helveticus,Lactobacillus casei,respectively.Using lactic acid bacteria and acetic acid bacteria mixed microorganism for static liquid fermentation,the strains addition ratio was optimized by Box-Behnken experiments,and the organic acid composition of grape vinegar was analyzed.The results showed that the optimized inoculum for grape vinegar fermentation with strains YCA-6,YCL-5 and YCL-6 were 3.0%,5.0%and 5.0%,respectively.Under the conditions,the total acid(in acetic acid)of grape vinegar with mixed strains static fermentation was 6.5 g/100 ml.

Yongchun aged vinegar;acetic acid bacteria;lactic acid bacteria;grape vinegar

TS264.2

0254-5071（2017）10-0120-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.025

2017-07-19

國家自然科學基金資助項目（31201406）；天津市科技支撐計劃（16YFZCNC00650）

李 巖（1982-），男，碩士研究生，研究方向為發酵調味品生產技術。

*通訊作者：鄭 宇（1980-），男，副教授，博士，研究方向為食品發酵過程和微生物功能分析。